十溴聯(lián)苯醚染毒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NMDA受體的影響

楊 清，吳思謀，汪春梅，湯 艷

西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院：1.公共衛(wèi)生；2.預(yù)防醫(yī)學(xué)（瀘州 646000）

十溴聯(lián)苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）是一種高產(chǎn)量溴化阻燃劑，是多溴聯(lián)苯醚類（PBDEs）阻燃劑中使用最廣泛的一種，適用于橡膠及塑料制品、紡紗、電子等行業(yè)[1-2]。十溴聯(lián)苯醚因?yàn)榛瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、在生物體中的蓄積能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在生產(chǎn)生活中可經(jīng)多種途徑進(jìn)入機(jī)體并蓄積。國(guó)內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，十溴聯(lián)苯醚具有致癌、生殖毒性、神經(jīng)毒性作用等[3-6]。中國(guó)的阻燃劑需求量被認(rèn)為是亞洲最高的國(guó)家，國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，與國(guó)外相同行業(yè)的職業(yè)人群相比，中國(guó)電子廢棄物處理廠的設(shè)備拆卸工人暴露于十溴聯(lián)苯醚的含量高50倍～200倍[7-8]，提示中國(guó)橡膠、電子產(chǎn)品等行業(yè)工人的職業(yè)暴露相比國(guó)外更多，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害可能更加嚴(yán)重。NMDA受體是一種谷氨酸門控離子通道，廣泛分布于人和哺乳動(dòng)物大腦海馬回中的各個(gè)區(qū)域，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸交流以及傳遞神經(jīng)遞質(zhì)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，因此被認(rèn)為在動(dòng)物的學(xué)習(xí)以及維持記憶方面有著重要的作用[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，NMDA 受體的激活與記憶的形成有關(guān)[12]，其在大腦海馬組織表達(dá)的相對(duì)數(shù)量變化以及功能異常可能是導(dǎo)致大腦記憶力下降的原因之一[13]。本研究針對(duì)BDE-209 的職業(yè)暴露在前期研究的基礎(chǔ)上探討了BDE-209染毒對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶和NMDA受體的影響，以探究BDE-209損害學(xué)習(xí)記憶的可能機(jī)制，為預(yù)防BDE-209的職業(yè)神經(jīng)毒性提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象、分組及染毒方法

選用符合標(biāo)準(zhǔn)的健康雄性SPF級(jí)SD大鼠32只（由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，經(jīng)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：2015002），體重250～300 g。動(dòng)物房需要自然采光。溫度和相對(duì)濕度分別控制在（25±1）℃和（50±10）%。飼喂大鼠的墊層每天更換，每周清洗。在實(shí)驗(yàn)中，用自來(lái)水及完全營(yíng)養(yǎng)的飼料喂養(yǎng)。

在飼養(yǎng)性喂養(yǎng)1 周后，將32 只大鼠按數(shù)字隨機(jī)法分至4個(gè)不同處理組，包括對(duì)照組（花生油），低，中，高劑量（250，500，1 000 mg/kg）BDE-209 染毒組。將染毒溶劑BDE-209 按照不同濃度溶解于花生油中，于每天9：00～11：00 進(jìn)行管飼染毒，容量為5 mL/kg。對(duì)照組以相同的方式接受5 mL/kg 花生油處理，每天一次，持續(xù)30 d。

1.2 儀器和試劑

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（北京碩林苑科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；超低溫冰箱（美國(guó)Forma 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD 公司）；高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；制冰機(jī)（日本三洋公司）；RT-PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀（美國(guó)Nanodrop 公司）。

BDE-209（美國(guó)AccuStandard 公司）；Rever Tra Ace聯(lián)合RT-PCR 試劑盒（成都博瑞克生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑和二亞丙二酯（Invitrogen 公司）；溴化乙錠（上海生物工程有限公司）；所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的測(cè)定

染毒結(jié)束后，用Morris 水迷宮檢測(cè)BDE-209 暴露對(duì)成年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)行4 d 的定航實(shí)驗(yàn)，將大鼠面朝池壁依次按照東、西、南、北四個(gè)起始位置放入已經(jīng)渾濁處理的水中，讓它們?cè)谒刂凶杂捎蝿?dòng)尋找平臺(tái)。在120 s內(nèi)，如果大鼠找到平臺(tái)，信息收集系統(tǒng)將自動(dòng)停止計(jì)時(shí)；如果大鼠未找到平臺(tái)，它將被引導(dǎo)至該位置并停留10 s，記錄120 s的逃生潛伏期。

1.3.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 第5 d，將大鼠以同樣的方式（面朝池壁）從原始平臺(tái)的另一側(cè)放入水中，并記錄120 s內(nèi)穿過(guò)原有平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，即垮臺(tái)次數(shù)。

1.4 大鼠海馬組織內(nèi)NMDA受體亞單位相對(duì)含量的測(cè)定

1.4.1 取材 在水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第2 d，用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，斷頸處死，在冰臺(tái)上對(duì)海馬組織進(jìn)行剝離，洗凈用冰NS 水（生理鹽水），將海馬組織快速冰凍固定，－80℃冰箱保存。

1.4.2 海馬組織總RNA 的提取 將放置于－80°C 冰箱中的海馬組織樣本取80 mg，剪切成小塊并全部轉(zhuǎn)移到組織均漿器中，加入1 mL Trizol試劑均勻化處理，再放置于室溫條件下靜置5 min后，加入0.2 mL氯仿并充分搖晃震蕩15 s。再次在室內(nèi)環(huán)境溫度下靜放5 min，并離心15 min。通過(guò)加入1 mL 75 %乙醇徹底混合底部RNA沉淀，離心并棄去清液層。將離心管放在干凈的吸水性紙上，于室內(nèi)環(huán)境溫度下干燥10 min，再用RNase-free的ddH2O溶解。核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)器上檢測(cè)提取的總RNA的濃度和純度。

1.4.3 cDNA 的合成 以1 μg 總RNA 為模板，配置20 μL 反應(yīng)系統(tǒng)：總RNA 1 μg，dNTP Mixture 2 μL，5×RT buffer 4 μL，Super RI 0.5 μL，RF增強(qiáng)劑0.5 μL，隨機(jī)引物1 μL，Rever Tra Ace反轉(zhuǎn)錄酶1 μL組成，補(bǔ)充DEPC水至最終體積20 μL。根據(jù)以下步驟進(jìn)行cDNA 合成：30°C持續(xù)10 min，42°C持續(xù)20 min，99°C持續(xù)5 min。

1.4.4 PCR目的基因擴(kuò)增 將上述產(chǎn)物用于進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含cDNA 2 μL，2×Taq PCR Mas?terMix 10 μL，上游和下游引物各1 μL，并補(bǔ)足水至20 μL 的最終體積?；蛎Q，相應(yīng)的引物序列和擴(kuò)增條件示于表1中。

1.5 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析軟件選用SPSS 25.0，計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)用單因素重復(fù)方差分析，多樣本均值的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用于LSD 法，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCR 分析軟件Quantity One 用于檢測(cè)RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的光密度值，目的基因與內(nèi)參基因光密度比值反映目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 成年大鼠學(xué)習(xí)記憶情況

2.1.1 定航實(shí)驗(yàn) 染毒劑量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間有交互作用（F組別*時(shí)間=3.71，P<0.05）；不同時(shí)間段各組成年大鼠的逃生潛伏期均有差異（P <0.05），隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)增加，逃生潛伏期呈下降趨勢(shì)（P<0.05）；在同一時(shí)間期，對(duì)照組大鼠的逃生潛伏期較染毒組有明顯的縮短（P<0.05），隨著染毒劑量增加，逃生潛伏期呈上升趨勢(shì)（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 BDE-209染毒對(duì)成年大鼠逃生潛伏期的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of BDE-209 exposure on escape latency of adult rats（±s，n=8）

表2 BDE-209染毒對(duì)成年大鼠逃生潛伏期的影響（±s，n=8）Table 2 Effect of BDE-209 exposure on escape latency of adult rats（±s，n=8）

注：與溶劑對(duì)照組比較，aP< 0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中量組比較，cP< 0.05；與第1 d比較，dP< 0.05；與第2 d比較，eP< 0.05；與第3 d比較，fP< 0.05

2.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 與溶劑對(duì)照組和低劑量組比較，中、高劑量組成年大鼠跨臺(tái)次數(shù)均減少，皆有顯著性差異（P<0.05），高劑量組成年大鼠的跨臺(tái)次數(shù)顯著低于中劑量組（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 BDE-209染毒對(duì)成年大鼠跨臺(tái)次數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of BDE-209 exposure on cross-platform times in adultrats（±s，n=8）

表3 BDE-209染毒對(duì)成年大鼠跨臺(tái)次數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of BDE-209 exposure on cross-platform times in adultrats（±s，n=8）

注：與溶劑對(duì)照（0 mg/kg）組和低劑量組比較，aP< 0.05；與中劑量組比較，bP< 0.05

2.2 成年大鼠海馬組織NMDA 受體亞單位mRNA 相對(duì)表達(dá)情況

2.2.1 成年大鼠海馬組織NR1亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況 由圖1可見(jiàn)，大鼠海馬體中NR1 mRNA相對(duì)含量與溶劑對(duì)照組相比，存在顯著差異（F=321.01，P <0.001）。各劑量BDE-209 染毒組大鼠海馬NR1 mRNA表達(dá)的相對(duì)含量顯著低于溶劑對(duì)照組（P<0.05），隨著BDE-209 染毒劑量的升高，NR1亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。

圖1 各組成年大鼠海馬組織NR1亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure 1 Relative expression of NR1 subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.2 成年大鼠海馬組織NR2A亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況 由圖2 可見(jiàn)，大鼠海馬體中NR2A mRNA相對(duì)含量與溶劑對(duì)照組相比，存在差異顯著（F=18.69，P <0.001）。低、中、高劑量BDE-209 染毒組成年大鼠海馬NR2A mRNA表達(dá)的相對(duì)含量顯著低于溶劑對(duì)照組（P <0.05）；且中劑量組低于低劑量、高劑量組（P <0.05）。

圖2 各組成年大鼠海馬組織NR2A亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure 2 Relative expression of NR2A subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.3 成年大鼠海馬組織NR2B亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況 由圖3 可見(jiàn)，大鼠海馬體中NR2B mRNA相對(duì)含量與溶劑對(duì)照組相比，存在差異顯著（F=180.87，P <0.001）。各劑量BDE-209 染毒組成年大鼠海馬NR2B mRNA表達(dá)的相對(duì)含量顯著低于溶劑對(duì)照組（P<0.05），隨著BDE-209 染毒劑量的升高，NR2B 亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。

圖3 各組成年大鼠海馬組織NR2B亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure 3 Relative expression of NR2B subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.4 成年大鼠海馬組織NR2C亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況 由圖4 可見(jiàn)，大鼠海馬體中NR2C mRNA相對(duì)含量與溶劑對(duì)照組相比，存在顯著差異（F=12.17，P<0.001）。與溶劑對(duì)照組比較，各劑量BDE-209染毒組大鼠海馬NMDA受體NR2C 亞單位mRNA 表達(dá)的相對(duì)含量均降低（P<0.05）；低、中、高染毒組之間NR2C亞單位mRNA的相對(duì)表達(dá)含量沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。

圖4 各組成年大鼠海馬組織NR2C亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure 4 Relative expression of NR2C subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.5 成年大鼠海馬組織NR2D亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況 由圖5 可見(jiàn)，大鼠海馬體中NR2D mRNA相對(duì)含量與溶劑對(duì)照組相比，總體存在顯著差異（F=22.14，P<0.001）。高劑量BDE-209染毒組成年大鼠海馬NR2D mRNA表達(dá)的相對(duì)含量明顯低于溶劑對(duì)照組、低、中劑量染毒組（P<0.05）；溶劑對(duì)照組、低、中劑量染毒組之間NR2D mRNA的相對(duì)表達(dá)含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖5 各組成年大鼠海馬組織NR2D亞單位mRNA相對(duì)表達(dá)情況Figure 5 Relative expression of NR2D subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

3 討論

3.1 BDE-209染毒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)等，是一種測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置覺(jué)和空間定位學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[14]。逃生潛伏期是反映受試動(dòng)物在定航實(shí)驗(yàn)中對(duì)空間信息的收集處理然后再利用，順利找到隱藏在渾濁水中的平臺(tái)，從水中逃脫的能力；垮臺(tái)次數(shù)是反映受試動(dòng)物找到原有平臺(tái)位置的記憶能力，這兩個(gè)指標(biāo)綜合反映了受試毒物對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同一訓(xùn)練時(shí)間，與溶劑對(duì)照組比較，BDE-209染毒的各劑量組成年大鼠的逃生潛伏期延長(zhǎng)，且隨著染毒劑量的增加而增加，垮臺(tái)次數(shù)減少，且隨著染毒劑量的增加而降低，這與前期課題組對(duì)大鼠BDE-209 染毒的結(jié)果[15]一致，再次證實(shí)BDE-209 具有一定的神經(jīng)行為毒性。BDE-209是一種常用的電子阻燃劑，在電子設(shè)備生產(chǎn)回收業(yè)中廣泛使用，在這些行業(yè)的職業(yè)人員長(zhǎng)期低濃度的暴露于BDE-209，其血清中的BDE-209 濃度遠(yuǎn)高于一般人群[16]，說(shuō)明相對(duì)于一般人群，BDE-209對(duì)職業(yè)暴露人群的神經(jīng)系統(tǒng)損害的程度更為嚴(yán)重[17-18]。

3.2 NMDA受體與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系

NMDA受體是興奮性氨基酸受體（excitatory amino acids receptor，EAAR），于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，在海馬及大腦皮層分布最為密集[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體在大腦海馬組織表達(dá)的相對(duì)數(shù)量變化以及功能異常，可能是導(dǎo)致大腦記憶力下降的原因之一[13]。NMDA 受體是由四個(gè)不同作用的單體組成的多聚體，目前發(fā)現(xiàn)組成NMDA 受體的亞單位有3 種類別：NR1、NR2（NR2A-NR2D）、NR3（NR3A、NR3B）[21-22]。NR1是NMDA 受體的基本功能單位，在人和哺乳動(dòng)物的中樞系統(tǒng)中的分布呈現(xiàn)廣泛性，NR1亞單位的減少將直接影響NMDA受體的數(shù)量；NR2是調(diào)節(jié)亞單位，發(fā)揮著調(diào)節(jié)離子通道開(kāi)閉狀態(tài)的作用，其中的NR2B亞單位被認(rèn)為是“聰明基因”[23-24]，主要是由于NR2B亞單位的第589位天冬氨酸殘基對(duì)Ca2+的內(nèi)流起著決定性的作用[25]。GIELEN 等[26]發(fā)現(xiàn)，NR1與NR2亞基結(jié)合，才能形成高度活性功能的NMDA受體通道，調(diào)節(jié)Ca2+的內(nèi)流。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)大鼠進(jìn)行BDE-209染毒后，大鼠海馬體中的NR1和NR2B亞單位的數(shù)量顯著減少，隨著BDE-209染毒劑量的增加，觀察到相對(duì)表達(dá)含量呈遞減趨勢(shì)，提示BDE-209可能通過(guò)破壞大鼠海馬體中的NR1和NR2B亞單位的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致海馬組織中具有功能活性的NMDA受體的數(shù)量減少，失去對(duì)Ca2+的調(diào)控作用，從而使學(xué)習(xí)記憶能力下降。

NR2家族的其他成員也是組成NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，NR2A主要分布在皮層和海馬等部位，NR2C主要分布在小腦，NR2D則在皮質(zhì)下區(qū)域以及腦干間腦部位存在[27]。在本實(shí)驗(yàn)中，BDE-209染毒會(huì)引起大鼠海馬組織中NR2A和NR2C亞單位數(shù)量減少，提示BDE-209可以破壞NR2A和NR2C亞單位結(jié)構(gòu)；高劑量的BDE-209 染毒會(huì)導(dǎo)致大鼠海馬組織中NR2D亞單位的數(shù)量降低，這提示當(dāng)BDE-209濃度較高時(shí)，對(duì)NR2D亞單位結(jié)構(gòu)也有損害作用，導(dǎo)致NMDA 功能活性受體數(shù)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力降低。

4 結(jié)論

BDE-209染毒可能對(duì)NMDA受體各亞單位有直接損害作用，但不同亞單位對(duì)BDE-209 濃度的敏感性不同。BDE-209 對(duì)NMDA 受體各亞單位的損害使NMDA受體數(shù)量下降，可能是影響大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力下降的原因之一。

（利益沖突：無(wú)）