淫羊藿苷通過調(diào)控中樞CRF和HPA軸影響抑郁動物模型神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能*

劉運琴,戢漢斌,肖文昊,林 麗

(1.武漢市武東醫(yī)院/武漢市第二精神病院精神科,武漢 430084;2.武漢市武東醫(yī)院/ 武漢市第二精神病院精神康復(fù)科,武漢 430084;3.武漢市武東醫(yī)院/武漢市 第二精神病院老年精神科,武漢 430084;4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 分子細(xì)胞生物學(xué)實驗室,武漢 430065)

抑郁癥是一組以持續(xù)心境低落、興趣減退為主要特征的綜合征,常伴有認(rèn)知功能損害、飲食睡眠障礙、抑制活動減退及各種軀體癥狀,是全球范圍內(nèi)的常見精神障礙性疾病[1]。近年來抑郁癥的發(fā)病呈現(xiàn)逐年升高的趨勢,WHO預(yù)測抑郁癥可能成為僅次于心血管疾病的人類第二大致殘因素[2]。盡管有大量研究從各個方面對抑郁癥的發(fā)病原因及機制進(jìn)行了研究,但目前抑郁癥的發(fā)病機制仍沒有準(zhǔn)確的定論。探討抑郁癥的發(fā)病機制、早期診斷并給予有效治療成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點[3]。淫羊藿苷是淫羊藿有效成分的活性單體,具有提高心腦血管血流量、促進(jìn)造血、骨代謝及延緩衰老等功能[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷可穿透血腦屏障發(fā)揮抗神經(jīng)元損傷、促神經(jīng)突觸生長、提高性功能和抗抑郁等作用[5]。張聰?shù)萚6]研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷顯著增加皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁大鼠蔗糖攝入量和海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平,降低了強迫游泳實驗(forced swim test,FST)的不動時間,具有較強的抗抑郁活性,但其對神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響尚不明確。本實驗以80只清潔級SD小鼠為觀察對象,旨在分析淫羊藿苷影響抑郁動物模型神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能及其相關(guān)機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級SD小鼠80只,雄性,8周齡,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,實驗動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。(23±2)℃、(55±2)%濕度的相對恒定飼養(yǎng)環(huán)境,光暗周期為12 h,環(huán)境保持安靜。本實驗動物實驗操作均符合《實驗動物管理條例》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。淫羊藿苷(純度>98%)由上海市融禾醫(yī)藥公司提供。

1.2 方法

1.2.1分組

將SD小鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量組及高劑量組,其中模型組、低劑量組及高劑量組建立社交應(yīng)激抑郁模型,對照組不予處理。

1.2.2社交應(yīng)激抑郁模型建立

以CD1小鼠為定居者,單籠飼養(yǎng)2周。SD小鼠為入侵者,放入定居者的籠子里,為保護(hù)自己的領(lǐng)地,定居者會撕咬入侵者,10 min后將定居者與入侵者用帶孔的有機玻璃擋板分開,在同一籠子里相處1 d,讓入侵者感受到來自定居者的視覺及聽覺威脅,而非撕咬。之后將入侵者送入新的定居者籠子里,重復(fù)上述操作10 d。最后將SD小鼠單籠飼養(yǎng),對其進(jìn)行社交孤立28 d。

1.2.3給藥

社交應(yīng)激10 d后,低劑量組及高劑量組分別給予30、60 mg/kg淫羊藿苷灌胃,對照組及模型組分別給予生理鹽水灌胃,給藥28 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1社區(qū)區(qū)域停留時間

在給藥28 d后每籠放入新的CD1小鼠,對其進(jìn)行社會應(yīng)激,觀察并比較各組小鼠社區(qū)區(qū)域停留時間。

1.3.2曠場試驗

在安靜室內(nèi)將小鼠放置于敞箱底面的中心方格內(nèi),記錄小鼠在5 min中的運動,以穿越底面塊數(shù)為水平穿越格數(shù),觀察各組小鼠水平穿越格數(shù)。

1.3.3體重檢測

測量小鼠試驗后的體重,計算并比較各組小鼠體重水平。

1.3.4血清檢測

從心臟采血,于室溫靜置20 min,以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,小心分離血清,放入-70 ℃環(huán)境冷藏備用,避免反復(fù)凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.3.5下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素 (corticotropin releasing hormone,CRF)水平檢測

給藥第28天治療結(jié)束后24 h,將小鼠快速斷頭取下丘腦,稱重后放入1 mL生理鹽水中煮沸3 min,于勻漿器中均漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,取上清液按照CRF放免試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測各組小鼠CRF水平。

1.3.6垂體中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)及腎上腺皮質(zhì)肌動蛋白(actin of adrenal cortex,CORT)水平檢測

給藥第28天治療結(jié)束后24 h,將小鼠快速斷頭取垂體及腎上腺,稱重后放入含10% EDTA-Na230 μL的試管中,于勻漿器中均漿,4 ℃ 3 000 r/min離心10 min,取上清液按照ACTH、CORT試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測各組小鼠ACTH、CORT水平。

1.3.7放射性配基檢測糖皮質(zhì)激素受體(GR)最大結(jié)合容量

分離各組小鼠肝臟,PBS沖洗,剪碎、研磨,4 ℃ 175 000 g離心30 min,吸去上清液。BCA法測定蛋白濃度,調(diào)整蛋白濃度為10 mg/mL。加入5%的N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),冰浴3 min,4 ℃ 12 000 r/min離心3 min,吸去上清液。向總結(jié)合管和非特異性結(jié)合管中每管加入300 μL肝胞液,總結(jié)合管中加入[1,2,4-3H]-Dex,非特異結(jié)合管中加入[1,2,4-3H]-Dex及非標(biāo)記Dex。吸上清液400 μL加入5 mL液體閃爍液后用液體閃爍儀測量各管的cpm值。Schatchard分析求得肝胞液GR與3H-Dex特異結(jié)合的最大結(jié)合容量。

1.3.8Western blot檢測GR蛋白表達(dá)

取各組小鼠肝組織,加入蛋白裂解液勻漿,冰上裂解,4 ℃ 12 000 r/min離心20 min,取上清液。BCA法定量總蛋白,SDS-PAGE電泳分離。轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,室溫封閉。加入GR一抗4 ℃過夜。HRP標(biāo)記二抗,增強化學(xué)發(fā)光法顯色,曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學(xué)指標(biāo)水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠水平穿越格數(shù)、社區(qū)區(qū)域停留時間及體重明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠水平穿越格數(shù)、社區(qū)區(qū)域停留時間及體重明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)指標(biāo)水平比較

2.2 各組小鼠炎癥指標(biāo)水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯高于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠炎癥指標(biāo)水平比較

2.3 各組小鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸相關(guān)激素水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯高于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 各組小鼠HPA軸相關(guān)激素水平比較

2.4 各組小鼠GR結(jié)合力比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠GR結(jié)合力明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠GR結(jié)合力明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠GR結(jié)合力比較

2.5 各組小鼠GR蛋白表達(dá)水平比較

模型組、低劑量組、高劑量組小鼠GR蛋白水平明顯低于對照組,低劑量組和高劑量組小鼠GR蛋白水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

a：P<0.05,與對照組比較；b：P<0.05,與模型組比較；c：P<0.05,與低劑量組比較。

3 討 論

抑郁癥是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙。WHO調(diào)查顯示,目前全球有四億人患有抑郁癥,心理疾病已成為全球第四大疾病[7]。目前治療抑郁癥的藥物較多,但仍有33%的患者抗抑郁治療效果較差,且部分抗抑郁藥物長期服用后的不良反應(yīng)明顯,對患者身體傷害較大,因此尋找一種低毒、有效的抗抑郁藥成為目前抑郁癥相關(guān)研究的主要方向[8]。

中醫(yī)認(rèn)為,腎虛肝郁是抑郁癥的主要證型之一[9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎虛證涵蓋了神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫免疫網(wǎng)絡(luò)的紊亂,其中HPA軸及免疫功能紊亂是其主要體現(xiàn)。ZHOU等[10]研究表明,重度抑郁患者存在HPA軸及免疫功能紊亂,這與腎虛證存在相似的病理生理基礎(chǔ)。淫羊藿是中醫(yī)溫補腎陽的常見藥物,性溫,味辛甘,歸肝腎經(jīng),具有滋補肝腎、壯陽、祛風(fēng)濕、改善免疫功能、鎮(zhèn)靜、抑制腸道病毒及強筋骨等功能。淫羊藿苷是由淫羊藿提取、分離、純化而來,屬于黃酮類,具有保護(hù)神經(jīng)、成骨、抗癌、抗炎及抗氧化功能[11]。方麗媛等[12]研究表明,淫羊藿苷可通過提高乙酰膽堿酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性降低氧化應(yīng)激，減輕老年癡呆小鼠類老年癡呆病理癥狀,且存在一定的劑量依賴性。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠水平穿越格數(shù)、社區(qū)區(qū)域停留時間及體重明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高。淫羊藿苷可明顯改善抑郁小鼠的社交活動,減輕小鼠抑郁狀態(tài)。

研究[13]認(rèn)為,免疫系統(tǒng)的過度激活是抑郁癥發(fā)病的重要機制之一,其中IL-6及TNF-α等神經(jīng)炎癥因子成為研究的重點。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等釋放的一種炎癥因子。KURANOBU等[14]研究表明,新生幼鼠皮下注射TNF-α,成年后出現(xiàn)抑郁性癥狀的概率大大升高。IL-6由淋巴細(xì)胞及非淋巴細(xì)胞釋放,可介導(dǎo)炎性反應(yīng)。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠IL-6、TNF-α水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低。提示淫羊藿苷可通過降低抑郁小鼠炎性反應(yīng)，改善抑郁癥狀,與ZHANG等[15]的研究結(jié)果相近。

抑郁癥患者糖皮質(zhì)水平低下與慢性炎癥并存,GR下調(diào)是重要原因之一,MEGAN等[16]研究證明,GR與抑郁存在密切聯(lián)系,GR下調(diào)的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)激后出現(xiàn)抑郁狀態(tài)的概率較高。HPA軸參與控制機體的應(yīng)激反應(yīng),調(diào)節(jié)心情、情緒、性行為及免疫系統(tǒng)等心理身體活動,下丘腦分泌的CRH可刺激ACTH的分泌,同時ACTH可調(diào)控CORT的表達(dá),而CORT則可反向控制CRH及ACTH的水平[17]。HPA軸是人類行為反應(yīng)及適應(yīng)壓力的中心。既往研究表明,抑郁癥的發(fā)生與HPA軸功能亢進(jìn)存在密切聯(lián)系[18]。NORMANN等[19]研究表明。老年抑郁癥患者自殺發(fā)生率與HPA軸紊亂存在一定聯(lián)系,密切監(jiān)測HPA軸的變化可明顯降低患者自殺率。本實驗中,低劑量組、高劑量組小鼠GR結(jié)合力及GR蛋白水平明顯高于模型組,且隨劑量的增加而升高。低劑量組、高劑量組小鼠CRF、ACTH、CORT水平明顯低于模型組,且隨劑量的增加而降低。提示淫羊藿苷良性調(diào)整抑郁小鼠社交行為及神經(jīng)內(nèi)分泌功能可能與淫羊藿苷通過調(diào)控GR蛋白水平調(diào)節(jié)CRF及HPA軸相關(guān)激素表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,淫羊藿苷可良性調(diào)整抑郁小鼠社交行為及神經(jīng)內(nèi)分泌功能,降低小鼠慢性炎性反應(yīng),其機制可能與淫羊藿苷通過調(diào)控GR蛋白水平調(diào)節(jié)CRF及HPA軸相關(guān)激素表達(dá)有關(guān)。