脂肪乳通過LPS/TLR4通路對急性有機磷中毒肺損傷的治療作用研究*

李 剛,韓楠楠,張 可,李恒杰

(浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院急診醫(yī)學科,杭州 310014)

急性有機磷中毒(acute organophosphorus poisoning,AOPP)是我國最常見的急性農(nóng)藥中毒之一,其造成的急性呼吸衰竭是致死的重要因素[1]。AOPP患者臨床救治包括使用阿托品、膽堿酯酶復能劑,輔以洗胃、血液灌流等綜合治療[2-3]。然而經(jīng)上述治療,患者仍可出現(xiàn)急性肺損傷表現(xiàn),導致治療較為棘手。本團隊前期的研究及其他研究結(jié)果顯示,脂肪乳與阿托品、解磷定聯(lián)合應用,可以減輕AOPP癥狀,降低病死率,加快膽堿酯酶恢復,減輕AOPP導致的肺損傷[4-6]。但是當時的實驗未明確脂肪乳對AOPP肺損傷治療作用的具體機制。近年來有文獻[7]報道,AOPP發(fā)生后,脂多糖(LPS)/Toll樣受體4(TLR4)表達明顯升高,同時NF-κB蛋白在各組織中表達也明顯增加,并且LPS/TLR4升高和降低與炎癥細胞因子是一致的,并且,給予治療干預后,LPS/TLR4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、NF-κB均有下降。本研究旨在前期實驗結(jié)果的基礎上,進一步探討LPS/TLR4通路在脂肪乳對AOPP大鼠肺損傷治療過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

健康成年封閉Sprague-Dawley大鼠50只,雌雄各半,體重(280±20)g[動物使用許可證號SCXK(滬)2017-0012；合格證號20170012005541],由上海吉輝實驗動物有限公司提供。90%敵敵畏(批號：20200813001,荊州安道麥股份有限公司),20%脂肪乳(批號：80PF033,費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司),阿托品注射液(批號：1811161,天津金耀制藥),氯解磷定[批號：19032701,開封制藥(集團)有限公司]。LPS/TLR4拮抗劑(批號：66229,美國Med Chem Express有限公司)

1.2 動物飼養(yǎng)條件和飼料

飲用水為滅菌二級超純水,飲用水質(zhì)量符合中華人民共和國國家標準《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5749-2006)的規(guī)定。實驗動物房使用許可證號SYXK(浙)2015-0008,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%。在動物房環(huán)境中適應2周。維持飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供,執(zhí)行標準GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。

1.3 方法

1.3.1模型制備

將50只大鼠隨機(數(shù)字隨機法)分為A組(鹽水對照組)、B組(脂肪乳對照組)、C組(標準治療組)、D組(脂肪乳治療組)、E組(LPS/TLR4拮抗劑組)5組,每組10只,5組大鼠均給予90%敵敵畏7 mg/kg腹腔注射染毒(藥物劑量是使用該廠家藥物預實驗確定,確保符合急性重度有機磷中毒且染毒后不會立刻全部死亡)。各組染毒后立即給予不同藥物治療,A組染毒后尾靜脈注射生理鹽水(5 mL/kg)；B組染毒后尾靜脈注射20%脂肪乳(5 mL/kg)；C組染毒后立即予阿托品(10 mg/kg)和氯解磷定(40 mg/kg)肌肉注射；D組在C組的基礎上聯(lián)合應用20%脂肪乳(5 mL/kg)尾靜脈注射。E組在D組的基礎上應用LPS/TLR4拮抗劑(0.5 mg/kg)尾靜脈注射。觀察24 h內(nèi)各組大鼠流涎發(fā)生率,統(tǒng)計肌束震顫評分,評分標準：無肌束震顫為0分；口周肌肉出現(xiàn)肌束震顫而其他肌肉偶見肌束震顫為1分；腹肌、后肢肌多處出現(xiàn)肌束震顫為2分；腹肌、后肢肌頻繁出現(xiàn)多發(fā)性肌束震顫為3分。記錄各組大鼠24 h存活率。

1.3.2標本采集、HE染色、熒光定量PCR及流式細胞術(shù)檢測

染毒后4 h使用毛細導管眶下采血1 mL,用HITACHI7170全自動生化儀測定全血膽堿酯酶活性。染毒24 h后取各組大鼠予腹腔注射5%水合氯醛6 mL/kg麻醉后,立即打開胸腔,無菌條件下分離并取出肺臟,4%甲醛溶液中固定5 d,然后修塊、脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色,鏡下觀察標本的結(jié)構(gòu)。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測肺組織中IL-6、TNF-α、 NF-κB mRNA相對表達量。制備肺細胞懸液,流式細胞術(shù)檢測肺細胞懸液中LPS/TLR4表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠中毒表現(xiàn)和存活情況比較

敵敵畏染毒后,A組和B組中毒癥狀出現(xiàn)較早,A組大鼠均出現(xiàn)了流涎、肌束震顫、躁動、站立不穩(wěn)等中毒癥狀。染毒后24 h內(nèi)A組只有3只大鼠存活,B組只有4只存活。C組、D組、E組上述癥狀出現(xiàn)較晚,呼吸困難、肌束震顫、流涎較A組、B組輕。D組與A組、B組、C組3組相比較,存活率明顯升高、流涎率明顯降低、肌束震顫評分最低、全血膽堿酯酶活性明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E組大鼠存活率達90%,而流涎率只有20%,和其余4組比較,存活率、全血膽堿酯酶活性最高,而流涎率、肌束震顫評分最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠存活率、流涎率及肌束震顫評分、CHE比較

2.2 各組大鼠肺組織病理學改變

A組肺泡間隔增寬伴水腫及組織間充血,炎癥細胞浸潤,血管周圍疏松水腫、滲出；B組可見肺泡間隔增寬及組織間充血,并見炎癥細胞浸潤；C組肺泡間隔略增寬,可見少量炎癥細胞浸潤及紅細胞滲出；D組可見少量炎癥細胞浸潤及紅細胞滲出；E組肺泡間隔略增寬,可見少量炎癥細胞浸潤及紅細胞滲出,見圖1。

A：A組；B：B組；C：C組；D:D組；E：E組。黑色箭頭:炎癥細胞浸潤;紅色箭頭:出血。

2.3 各組大鼠肺組織IL-6、TNF-α、NF-κB表達量

B組與A組比較，大鼠肺組織IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)；C組與A組比較，大鼠肺組織IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)；D組與C組比較，大鼠肺組織IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01)；IL-6、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達量顯著降低(P<0.01),見圖2。

##:P<0.01,與A組比較；**:P<0.01,與A組比較；△△:P<0.01,與C組比較；□□:P<0.01,與D組比較。

2.4 各組大鼠肺細胞懸液中LPS/TLR4表達

與A組比較,B組肺細胞內(nèi)LPS/TLR4表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；D組的LPS/TLR4表達不但較A組、B組明顯下降,而且和C組比較,下降也較為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；E組和其余4組比較,LPS/TLR4表達均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義,見圖3。

圖3 大鼠肺細胞中LPS/TLR4表達

3 討 論

肺臟是AOPP較為常見的損傷部位,急性呼吸衰竭是AOPP導致患者死亡較為常見的原因[8]。相關研究[9-10]認為,急性呼吸衰竭的產(chǎn)生主要是由于乙酰膽堿大量積聚引起突觸后神經(jīng)肌肉接頭功能障礙,其又分為中毒型肺水腫型、呼吸中樞衰竭型、解毒劑過量型及中間綜合征型。臨床治療過程中除使用阿托品、解磷定治療外,對AOPP所致急性肺損傷無明確有效的治療藥物。本實驗結(jié)果顯示,脂肪乳治療組與鹽水對照組、脂肪乳對照組、標準治療組比較,大鼠的中毒癥狀明顯減輕、存活率升高、全血膽堿酯酶活性升高、肺組織病理改變明顯減輕,和前期研究[4]結(jié)果一致。從肺組織HE染色鏡下病理結(jié)構(gòu)改變的角度,再一次驗證了脂肪乳對AOPP所致肺損傷的治療作用。

TLR4跨膜蛋白是TOLL受體家族的成員之一[11-12],LPS脂多糖在應激及炎性反應過程中均可升高。LPS/TLR4通路激活會導致細胞內(nèi)NF-κB信號傳遞和生成炎癥細胞因子,如TNF-α和IL-6,這些因子在對外界刺激反應的識別和組織損傷過程中起到重要的作用[13]。LPS發(fā)生改變后組織中的TLR4、NF-κB及血液和組織中的TNF-α、IL-6的表達均會改變[14]。本實驗結(jié)果顯示,各組大鼠給予敵敵畏染毒后,肺組織LPS/TLR4明顯升高,同時NF-κB蛋白表達也明顯增加,并且LPS/TLR4的升降與炎癥細胞因子TNF-α、IL-6水平是一致的；給予阿托品、解磷定標準治療干預后,LPS/TLR4、TNF-α、IL-6、NF-κB均有下降,并且下降程度和鹽水對照組比較差異有統(tǒng)計學意義,同樣與中毒癥狀及肺組織損傷程度呈相關。說明AOPP在發(fā)病和治療過程中LPS/TLR4通路起到了重要作用,該實驗結(jié)果與文獻[4]報道一致。

本實驗發(fā)現(xiàn),無論是脂肪乳對照組和鹽水對照組比較,還是脂肪乳治療組和標準治療組比較,只要加入脂肪乳治療,該組實驗大鼠肺組織IL-6、TNF-α、NF-κB表達量均明顯下降,同時,肺細胞懸液中LPS/TLR4表達同步下降。眾所周知,脂肪乳具有結(jié)合LPS的特性,進而可抑制巨噬細胞的激活。脂肪乳中的磷脂和高密度脂蛋白,在體內(nèi)和體外結(jié)合LPS并可起到中和作用,LPS誘導的細胞因子反應會減弱。研究[12]表明,脂肪乳與LPS作用后,LPS即失去了結(jié)合能力,從而抑制TNF-α、IL-6的釋放。脂肪乳可以抑制LPS/TLR4,從而使TNF-α、IL-6釋放減少,TLR4與LPS拮抗劑結(jié)合,幾乎完全可以抑制TNF-α、IL-6釋放。本實驗結(jié)果顯示,LPS/TLR4阻斷組肺細胞懸液中LPS/TLR4表達、IL-6、TNF-α、NF-κB中mRNA相對表達量與其他4組相比是最低的。同時在實驗中還可以發(fā)現(xiàn),LPS/TLR4阻斷組AOPP癥狀最輕、存活率最高、膽堿酯酶活性最高、肺組織病理改變最接近于正常大鼠肺組織。

本實驗證明,脂肪乳可以減輕AOPP所致肺損傷；LPS/TLR4通路在治療AOPP所致肺損傷的過程中發(fā)揮了重要作用。