金龜子綠僵菌與殺蟲劑對黃曲條跳甲聯(lián)合毒力測定和保護酶活性影響

蔣春艷

（龍巖市農(nóng)業(yè)科學研究所，福建 龍巖 364000）

0 引言

黃曲條跳甲Phyllotreta striolata （Fabricius）屬鞘翅目葉甲科，是為害十字花科蔬菜的重要害蟲［1］。成蟲咬食葉片，造成孔洞，幼蟲為害根部，并能傳播土傳病害，如細菌性軟腐病和黑腐病等［2］。生產(chǎn)上，農(nóng)民為了控制該蟲的危害，加大了用藥量，提高了用藥頻率，從而加劇了抗性的發(fā)展，近年來，黃曲條跳甲被認為是最難防治的蔬菜害蟲之一［3］。

長期以來，黃曲條跳甲主要以化學藥劑防治為主。近年來也有應用生物防治真菌來防治黃曲條跳甲方面的研究，何越超［4］測定了8株金龜子綠僵菌對黃曲條跳甲的致病力，篩選出了對黃曲條跳甲致病力較強的一株菌株。同其他生物防治真菌一樣，綠僵菌殺蟲速度較慢，制約了它的田間應用［5］。有學者研究了綠僵菌與其他殺蟲劑的兼容性，企圖用其與殺蟲劑配伍來減少藥劑使用濃度、縮短害蟲的死亡時間和提高綠僵菌的防效［6］。

昆蟲病原真菌與常用殺蟲劑的相容性是害蟲綜合防治體系中的重要研究內容，對減少農(nóng)藥用量、簡化病蟲害防控技術、提高防治效果和降低應用成本等都具有重要的應用價值［7］。目前，對于利用金龜子綠僵菌和其他殺蟲劑配伍來防治黃曲條跳甲的報道不多，配伍后對其體內保護酶活性方面的研究也少見報道。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是生物體內重要的保護酶。SOD是生物細胞內最重要的清除自由基的酶，與生物體的自身防御和對殺蟲劑的耐藥性、抗逆性有關［8］；POD的主要功能是催化過氧化物對各種物質的氧化，可以通過消除毒性物質和過氧化氫，對細胞起到保護的作用；CAT在生物演化的過程中可通過催化細胞內的過氧化氫的分解而防止其過氧化，從而起到防御的作用［9］。酶抑制劑與某些常用殺蟲劑混用可提高對抗性黃曲條跳甲成蟲的防治［10］，有利于研究出新的防治方法。本研究開展了金龜子綠僵菌制劑與殺蟲劑配伍防治黃曲條跳甲，以期提高綠僵菌制劑的防治效果，為金龜子綠僵菌混合制劑的生產(chǎn)應用提供參考依據(jù)，也為黃曲條跳甲的防治提供新方法；同時，測定了黃曲條跳甲體內保護酶活性變化，確定了黃曲條跳甲感染混合藥劑后蟲體的調節(jié)機制及保護酶系統(tǒng)在蟲體免疫中的作用機理，為防治工作提供了理論基礎。

1.1 材料與方法

1.1.1 供試材料 供試作物：福建省龍巖市農(nóng)科所大棚種植的上海青。

供試蟲源：黃曲條跳甲成蟲采集于福建省龍巖市十字花科蔬菜地，室內以新鮮沒使用過任何農(nóng)藥的上海青葉片連續(xù)飼養(yǎng)72 h后進行毒力測定。

供試藥劑及試劑盒：80億孢子/mL金龜子綠僵菌CQMa421可分散油懸浮劑（重慶聚立信生物工程有限公司）、10%阿維菌素懸浮劑（華北制藥集團愛諾有限公司）、8000 IU/μL蘇云金桿菌懸浮劑（山東魯抗生物農(nóng)藥有限責任公司）、2.5%魚藤酮乳油（南通神雨綠色藥業(yè)有限公司）、0.3%印楝素乳油（成都綠金生物科技有限責任公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化物酶（POD）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，試劑盒均為蘇州科銘生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗方法 金龜子綠僵菌CQMa421配制成濃度為1.0×108個孢子/mL可分散油懸浮劑，阿維菌素懸浮劑濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L，蘇云金桿菌懸浮劑濃度梯度為1.92×108、3.84×108、7.68×108、1.54×109、3.07×109IU/L，魚藤酮乳油濃度梯度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/L，印楝素乳油濃度梯度為0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 mg/L。將配制好的金龜子綠僵菌CQMa421分別與其他4種藥劑各濃度混合，制成混合藥劑。

藥劑室內毒力測定采用浸葉法。參照國際抗性行動委員會的浸葉法（IRAC，1990），采集未施用任何藥劑的新鮮上海青葉片，分別在以上單劑、混合藥液中浸漬約15 s后取出，于通風處自然晾干后置于透明塑料瓶中，接入蟲齡大小一致的黃曲條跳甲成蟲，每個濃度3個重復，每個重復30頭成蟲，用80目防蟲網(wǎng)封口并置于溫度25（±1） ℃、相對濕度70%~80%，光周期14L∶10D的人工氣候箱內，以清水作空白對照。藥劑處理后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后檢查死亡蟲口數(shù)，計算死亡率和聯(lián)合作用結果。

混劑理論死亡率公式為：

其中：Pa、Pb分別為各單劑的試蟲死亡率。

協(xié)同毒力指數(shù)（c.f）公式為：

使用以上混合藥劑以相同方法處理一定數(shù)量的黃曲條跳甲成蟲，以清水作空白對照，每24 h取樣1次，連續(xù)取樣5次，測定黃曲條跳甲體內SOD、POD、CAT 3種保護酶活性，每處理重復3次。測定具體實驗步驟和計算方法參考試劑盒說明書。

1.2 數(shù)據(jù)處理

試驗結果采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，DPS軟件進行方差分析和多重比較差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 混合藥劑對黃曲條跳甲毒力測定結果

通過統(tǒng)計120 h內死亡的蟲口數(shù)，根據(jù)公式計算，判斷增效與否。以c.f值大小來定性評判2種藥劑混用的聯(lián)合作用，其中c.f≥20時為增效作用，c.f≤-20時為拮抗作用，-20＜c.f＜20時為相加作用。最后篩選出效果最佳的混配制劑。結果表明（表1），在120 h時，濃度為1.0×108個孢子/mL金龜子綠僵菌與阿維菌素、蘇云金桿菌、魚藤酮、印楝素不同濃度的混配劑中，金龜子綠僵菌與阿維菌素和蘇云金桿菌各濃度混配都有增效和相加的效果，其中效果最好的是濃度為1.0×108個孢子/mL金龜子綠僵菌與濃度為1.92×108IU/L蘇云金桿菌混配劑，協(xié)同毒力指數(shù)達到了165.0，其次為金龜子綠僵菌與低濃度的阿維菌素混配劑，協(xié)同毒力指數(shù)為96.0；金龜子綠僵菌與低濃度的魚藤酮混配也有增效作用，協(xié)同毒力指數(shù)為60.5，效果排第3。金龜子綠僵菌與印楝素各個濃度混配后，聯(lián)合作用結果都是拮抗作用。因此，金龜子綠僵菌與4種藥劑混配后，效果最好、毒力最強的是金龜子綠僵菌+蘇云金桿菌。

表1 金龜子綠僵菌與殺蟲劑混配對黃曲條跳甲毒力測定聯(lián)合作用結果

2.2 混合藥劑對黃曲條跳甲體內保護酶活性影響

2.2.1 混合藥劑對黃曲條跳甲體內SOD活性影響金龜子綠僵菌與4種殺蟲劑混用對黃曲條跳甲SOD活性影響如表2所示。在處理24 h時，金龜子綠僵菌與蘇云金桿菌所有混合處理中，除與濃度3.84×108IU/L和1.54×109IU/L混合SOD活性顯著低于對照外，與其他濃度混合SOD活性都顯著高于對照，金龜子綠僵菌與蘇云金桿菌最低濃度1.92×108IU/L混合時SOD活性最高，為190.270 U/g鮮重；金龜子綠僵菌與魚藤酮混合處理后，濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L時，SOD活性顯著高于對照，分別為185.575 U/g和176.567 U/g鮮重。藥后48 h時，金龜子綠僵菌與阿維菌素混合的各個濃度SOD活性上升到最高，均顯著高于對照，隨后下降。以上幾個處理對黃曲條跳甲防控作用較好，其中金龜子綠僵菌與蘇云金桿菌最低濃度1.92×108IU/L混合時效果最好。

表2 金龜子綠僵菌與殺蟲劑混用對黃曲條跳甲SOD活性的影響

2.2.2 混合藥劑對黃曲條跳甲體內POD活性影響金龜子綠僵菌與4種殺蟲劑不同濃度混合處理黃曲條跳甲后，120 h內其體內POD活性均出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，部分處理呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，對照處理處于相對平衡狀態(tài)（表3）。金龜子綠僵菌與阿維菌素各濃度混合處理后出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，濃度為0.01 mg/L混合處理96 h時，POD達到最高值，為666.667 U/g鮮重，48 h時各濃度POD活性均顯著低于對照，可能是受到侵害的初期機體還未啟動防御系統(tǒng)使POD活性降低，而后為了維持機體正常生理功能，POD活性逐漸上升；金龜子綠僵 菌 與 濃 度 為1.92×108IU/L和3.84×108IU/L蘇云金桿菌混合處理在120 h時達到最大值，分別為1573.333 U/g和1313.333 U/g鮮重，均顯著高于對照；金龜子綠僵菌與魚藤酮混合處理后POD活性均在120 h時達到最大值；與印楝素各濃度處理中，除濃度為0.48 mg/L混合處理外，其余濃度混合處理均在120 h時達到最大值，且顯著高于對照。

表3 金龜子綠僵菌與殺蟲劑混用對黃曲條跳甲POD活性的影響

2.2.3 混合藥劑對黃曲條跳甲體內CAT活性影響 混合藥劑對黃曲條跳甲體內CAT活性影響如表4所示，金龜子綠僵菌與4種殺蟲劑混合處理黃曲條跳甲120 h內，其體內CAT活性呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢。金龜子綠僵菌與阿維菌素各濃度混合處理后，濃度為0.01、0.02、0.04 mg/L時在48~72 h內CAT活性下降，96 h時達到最大值，隨后再次下降，其中與濃度為0.01 mg/L混合處理96 h時CAT活性達到最大值，為230.207 nmol/min/g鮮重，顯著高于對照；金龜子綠僵菌與蘇云金桿菌各濃度混合處理后，24 h時顯著高于對照，與濃度為1.92×108IU/L蘇云金桿菌混合處理后CAT活性達396.237 nmol/min/g鮮重；金龜子綠僵菌與魚藤酮各濃度混合處理后在120 h時CAT活性達到最高值，說明該混合藥劑在120 h時才充分發(fā)揮藥效。

表4 金龜子綠僵菌與殺蟲劑混用對黃曲條跳甲CAT活性的影響

3 討論

在蔬菜生產(chǎn)中，農(nóng)民為了控制黃曲條跳甲產(chǎn)生的危害，依然采用大量或單一化學藥劑進行控制，這樣不僅使蔬菜上農(nóng)藥殘留量增加，危害人類健康，還加劇了黃曲條跳甲抗性的發(fā)展，進而又繼續(xù)增大用藥量，形成了惡性循環(huán)。將微生物制劑與殺蟲劑混合使用是眾多生物防治制劑開發(fā)普遍采用的模式，這樣可以提高殺蟲效果，減少化學農(nóng)藥的用藥量，減緩抗藥性的產(chǎn)生，達到節(jié)約成本和綠色農(nóng)業(yè)的效果［11］，對保護環(huán)境和防御其他天敵也具有重要的意義［12］。本研究使用低劑量的生物防治真菌金龜子綠僵菌CQMa421分別與4種低毒殺蟲劑不同濃度混合，對黃曲條跳甲進行了室內聯(lián)合毒力測定和防御機制研究，篩選出了對黃曲條跳甲防控較好的混配劑，即1.0×108個孢子/mL金龜子綠僵菌+1.92×108IU/L蘇云金桿菌、1.0×108個孢子/mL金龜子綠僵菌+0.01 mg/L阿維菌素，為金龜子綠僵菌混合制劑在生產(chǎn)上防治黃曲條跳甲提供了參考依據(jù)。