60Co-γ射線及化學(xué)誘變劑對(duì)卷丹百合誘變效應(yīng)的研究

胡 瑤，李宏告，雷星宇，周毅吉，張 勇，李麗輝

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南 長沙 430125）

卷丹百合（Lilium lancifolium Thunb.）為百合科百合屬多年生草本植物。其花橙色或深紅色，美麗清雅，芳香宜人；其鱗莖是一種極具營養(yǎng)價(jià)值的保健品，具有很高的藥用價(jià)值，可以活血祛瘀、消腫止痛、養(yǎng)血安神、養(yǎng)陰潤肺止咳，還能治療和預(yù)防糖尿病等疾病［1］。百合為湖南道地中藥材，采用傳統(tǒng)種植模式進(jìn)行種植以及長期利用種球進(jìn)行繁殖導(dǎo)致百合品種退化現(xiàn)象嚴(yán)重，從而使百合良種的選育研究受到了限制。

輻照誘變技術(shù)具有突變率高、突變譜寬、后代性狀穩(wěn)定快、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為獲得新種質(zhì)資源的最有效途徑之一［2］。60Co-γ射線作為一種重要輻照源，在各種作物［3］、花卉［4-7］、中藥材［8-9］的育種中應(yīng)用廣泛。目前，已有關(guān)于60Co-γ射線誘變處理百合種球的研究報(bào)道，例如：趙興華等［10］對(duì)3種切花百合進(jìn)行60Co-γ誘變育種研究，結(jié)果表明適宜誘變劑量因品種不同而變化；李麗輝等［11］在研究60Co-γ射線輻射4種百合的誘變效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，金百合、湖北百合、岷江百合的適宜輻射劑量分別為2～4、2、2 Gy，而卷丹百合在本試驗(yàn)中未找到適宜的輻射劑量?；瘜W(xué)誘變作為傳統(tǒng)的植物誘變手段，其與輻照誘變技術(shù)結(jié)合作為植物育種手段的報(bào)道還比較少見。鑒于此，本試驗(yàn)采用不同劑量的60Co-γ射線并結(jié)合秋水仙素溶液處理卷丹百合的種球，觀察了在不同處理下卷丹百合的生物學(xué)效應(yīng)，以期為其輻照誘變結(jié)合化學(xué)誘變育種適宜劑量的選擇提供依據(jù)，為今后的卷丹百合誘變技術(shù)研究以及開展相關(guān)基因功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為卷丹百合的鱗莖，購買于湖南省龍山縣百合基地，種球大小基本一致，無病蟲害。

1.2 輻射處理

采用自封袋分裝供試卷丹百合的鱗莖，送往湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所生物輻照中心進(jìn)行60Co-γ射線輻射處理，輻射劑量分別為0、2、3、4、5 Gy，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)種球。

1.3 化學(xué)誘變劑處理

將輻照后的卷丹百合鱗莖清理干凈，放入0.1%秋水仙素溶液中，在振蕩器上浸泡12 h，然后取出，用蒸餾水清洗干凈，晾干。

1.4 生育指標(biāo)的調(diào)查

將經(jīng)輻射和化學(xué)誘變處理的卷丹百合種球在2020年12月16日栽種于盛有營養(yǎng)土的花盆中，進(jìn)行常規(guī)栽培管理。從各處理中隨機(jī)選取9株植株，測(cè)定其發(fā)芽率、存活率、株高、葉長、葉寬、節(jié)間距、花瓣長度與寬度、珠芽數(shù)等相關(guān)生長發(fā)育指標(biāo)，觀察記錄其變異情況，分析60Co-γ射線輻射結(jié)合化學(xué)誘變處理對(duì)卷丹百合植株形態(tài)的影響。

1.5 葉綠體色素及花朵色澤分析

葉綠體色素含量采用乙醇提取比色法［12］進(jìn)行測(cè)定；花色苷、類黃酮含量采用南京建成生物研究所的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.6 主要營養(yǎng)保健成分分析

檢測(cè)材料為卷丹百合的M1鱗莖。水分含量測(cè)定采用重量法（《食品中水分的測(cè)定》 GB/T 5009.3—2003）；多酚含量測(cè)定采用福林酚法［13］；類黃酮含量測(cè)定采用南京建成生物研究所的試劑盒；多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法［14］。對(duì)上述所有指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3次，取平均值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；使用最小顯著差數(shù)法（LSD）對(duì)不同處理間的指標(biāo)差異進(jìn)行多重比較。圖表繪制采用Office 2007軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘變方法對(duì)卷丹百合種球生長指標(biāo)的影響

2.1.1 種球發(fā)芽率、存活率及單株鮮重 自栽培日起70 d后，統(tǒng)計(jì)卷丹百合種球的發(fā)芽率，在120 d時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率。不同劑量的60Co-γ射線輻射結(jié)合化學(xué)誘變劑處理對(duì)卷丹百合種球的發(fā)芽率和存活率均有一定的影響。從表1可以看出：在處理1~5（不同輻射劑量處理）下卷丹百合種球的發(fā)芽率和存活率均隨著輻照劑量的增加而降低。具體來說，2 Gy處理的發(fā)芽率和存活率均較對(duì)照（CK）下降了8.3%；3 Gy和4 Gy處理的發(fā)芽率均較對(duì)照下降了11.1%，存活率則比發(fā)芽率下降得快，尤其是4 Gy處理較對(duì)照下降了75.0%；5 Gy處理的發(fā)芽率只有66.7%，但后期均死亡。處理6~10為輻射結(jié)合0.1%秋水仙素處理，其中處理6~8的卷丹百合種球的發(fā)芽率為100%；處理9和處理10的發(fā)芽率較對(duì)照分別下降了22.2%、33.3%；處理6的存活率為91.7%；處理7~9的存活率呈下降趨勢(shì)，分別較處理6下降了18.2%、27.3%、81.8%；處理10的存活率為0%。隨著輻照劑量的增加，卷丹百合的單株最大鱗莖鮮重呈下降趨勢(shì)，且輻照結(jié)合秋水仙素處理的卷丹百合單株最大鱗莖鮮重比單一輻照處理有所下降，說明輻射結(jié)合化學(xué)誘變處理對(duì)卷丹百合的球莖產(chǎn)量有一定的影響。

表1 不同誘變處理對(duì)卷丹百合種球發(fā)芽率和存活率的影響

2.1.2 卷丹百合的植株形態(tài) 為了進(jìn)一步探究不同誘變方式對(duì)卷丹百合植株生長的影響，對(duì)兩種誘變處理下卷丹百合的植株形態(tài)指數(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2。除已死亡的處理5、10外，隨著輻照劑量的增加，卷丹百合的株高呈明顯的下降趨勢(shì)，均較對(duì)照顯著下降，其中4 Gy及4 Gy+0.1%秋水仙素處理的株高下降幅度居前2位，較對(duì)照分別下降了73.0%、74.1%；2 Gy、3 Gy處理的株高下降，較適于盆栽。在2 Gy和3 Gy劑量60Co-γ射線輻射處理下，卷丹百合的葉片變長，寬度變窄，而且節(jié)間距急劇縮短，葉片生長非常緊湊。各處理的卷丹百合的單株珠芽數(shù)都隨著輻照劑量的增加而變少，3 Gy、4 Gy處理的單株珠芽數(shù)較對(duì)照顯著減少，且在植株頂端生長珠芽，未進(jìn)行花芽分化。葉形指數(shù)也是在3 Gy處理下達(dá)到最大值，較對(duì)照呈顯著差異。采用輻射+0.1%秋水仙素處理的卷丹百合的整體葉長較單一輻照處理短些，葉寬窄些。0~4 Gy輻射+0.1%秋水仙素處理的節(jié)間距較對(duì)照分別縮小了2.7%、43.5%、72.8%、81.6%，在4 Gy+0.1%秋水仙素處理下差異最顯著。各處理的單株珠芽數(shù)同樣較對(duì)照差異顯著，但3 Gy與4 Gy結(jié)合秋水仙素處理之間差異較小，說明節(jié)間距與單株珠芽數(shù)對(duì)輻射處理表現(xiàn)出較高的敏感性。

表2 兩種誘變方式對(duì)卷丹百合植株形態(tài)的影響

2.1.3 卷丹百合的花朵形態(tài) 由表3可知：在60Co-γ射線輻射處理及輻射+秋水仙素處理下卷丹百合的花瓣長度與對(duì)照相比差異顯著，但各處理間的差異不明顯；各處理卷丹百合的花瓣寬度及雄蕊長度變化很小，差異不顯著，說明其對(duì)60Co-γ射線輻射及0.1%秋水仙素處理不敏感；就卷丹百合的單株花朵數(shù)而言，2 Gy處理與對(duì)照差異不大，3 Gy、4 Gy處理逐漸減少，且各劑量輻照+0.1%秋水仙素處理均較對(duì)照有所減少，以4 Gy+0.1%秋水仙素處理的花朵數(shù)量最少，較對(duì)照減少了20.0%;各處理的開花歷期隨著輻射劑量的增加而減短，但開花始期存在不同程度的延遲，輻照劑量越大，延遲天數(shù)越多。

表3 2種誘變方式對(duì)卷丹百合花朵形態(tài)的影響

2.2 兩種誘變方法對(duì)卷丹百合花瓣色澤的影響

從圖1~圖2可以看出：在各處理間卷丹百合花瓣的類黃酮含量差異不顯著，只有4 Gy+0.1%秋水仙素處理的類黃酮含量比對(duì)照增加了55.31%，差異顯著；在各輻射處理間卷丹百合花瓣的花色苷含量差異較??；2 Gy輻射+秋水仙素處理的花色苷含量與對(duì)照差異不大；3 Gy+秋水仙素處理的花色苷含量較對(duì)照降低了21.36%；而4 Gy+秋水仙素處理的花色苷含量比對(duì)照增加了11.46%。

圖1 兩種誘變方式對(duì)卷丹百合花瓣花色苷含量的影響

圖2 兩種誘變方式對(duì)卷丹百合花瓣類黃酮含量的影響

2.3 兩種誘變方法對(duì)卷丹百合葉綠體色素的影響

葉綠素是自然界中植物進(jìn)行物質(zhì)代謝和能量代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是植物進(jìn)行光合作用的主要色素之一［15］。兩種誘變處理對(duì)卷丹百合葉綠體色素含量的影響如表4所示，3~4 Gy劑量60Co-γ射線輻射處理以及2~4 Gy輻射+0.1%秋水仙素處理下卷丹百合葉綠素a的含量均比對(duì)照高，以3 Gy輻射處理和3 Gy+0.1%秋水仙素處理的葉綠素a含量最高，均較對(duì)照提高了21.2%，差異顯著。在不同劑量的輻射處理中，只有3 Gy處理的卷丹百合葉綠素b含量較對(duì)照高，且在各輻照處理間葉綠素b含量差異不明顯。0~4 Gy輻射+0.1%秋水仙素處理的葉綠素b含量均比對(duì)照高。CK+0.1%秋水仙素處理的卷丹百合的類胡蘿卜素含量最低，與其他各處理差異顯著，較對(duì)照降低了61.8%。

表4 兩種誘變方式對(duì)卷丹百合葉綠體色素含量的影響

2.4 兩種誘變方法對(duì)卷丹百合鱗莖主要營養(yǎng)保健成分的影響

由表5可知:經(jīng)過輻射后卷丹百合鮮鱗莖的水分含量均比對(duì)照高；在復(fù)合誘變處理中，以2 Gy+0.1%秋水仙素處理的鮮鱗莖的水分含量最高，較對(duì)照增加了17.13%；鮮鱗莖的類黃酮含量隨著輻照劑量的增加呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，以3 Gy+0.1%秋水仙素處理的類黃酮含量最高，但與對(duì)照差異不顯著；單輻射處理以及復(fù)合誘變處理對(duì)卷丹百合多糖含量的影響不大，各處理間差異不明顯；各輻射處理卷丹百合的多酚含量均比對(duì)照顯著增加，但輻射+秋水仙素各處理的多酚含量低于相應(yīng)的單輻射處理，說明0.1%秋水仙素溶液會(huì)抑制卷丹百合鮮鱗莖中多酚的積累。

表5 兩種誘變方式對(duì)卷丹百合鮮鱗莖主要營養(yǎng)保健成分含量的影響

3 討論

輻照育種技術(shù)利用射線誘發(fā)農(nóng)作物遺傳物質(zhì)突變而引起性狀變異，是一種選育新品種、農(nóng)作物改良的有效途徑。60Co-γ射線作為常用的輻射源，可對(duì)植物的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的抑制或促進(jìn)作用［16］。秋水仙素會(huì)對(duì)正在分裂的細(xì)胞產(chǎn)生作用，因此，可以用一定濃度的秋水仙素溶液或乳劑對(duì)作物材料進(jìn)行浸漬、涂抹、滴液、注射等誘變處理［17］。

本試驗(yàn)采用60Co-γ射線輻射并結(jié)合化學(xué)誘變劑秋水仙素處理卷丹百合的鱗莖，結(jié)果表明，兩種誘變處理對(duì)卷丹百合的形態(tài)及生理生化指標(biāo)均產(chǎn)生了不同程度的影響。在5 Gy劑量處理下，卷丹百合鱗莖的存活率為0%；經(jīng)4 Gy處理后存活率只有25.0%；經(jīng)4 Gy+0.1%秋水仙素處理后存活率只有16.7%，這說明高劑量輻照抑制了卷丹百合鱗莖的存活，這與60Co-γ射線對(duì)小蒼蘭的生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)果［18］一致，但與朱校奇等［19］的研究結(jié)果“經(jīng)3 Gy處理后卷丹百合鱗莖的存活率為0%”有所不同，在本試驗(yàn)中卷丹百合的耐受劑量高些，5 Gy為致死劑量，這可能與輻照樣品催芽與否有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射處理以及輻射結(jié)合0.1%秋水仙素處理都會(huì)使卷丹百合的株高變矮、節(jié)間距變短、單株珠芽數(shù)減少，且這些指標(biāo)均與輻射劑量呈負(fù)相關(guān)，這些現(xiàn)象都符合60Co-γ射線對(duì)植物生長的誘變效應(yīng)，與60Co-γ射線對(duì)香梨［20］、月季［21］的輻射效應(yīng)，以及對(duì)觀賞海棠組培苗的誘變效應(yīng)［22］一致。但在本試驗(yàn)中，3 Gy劑量輻照處理的卷丹百合的葉長比對(duì)照顯著變長，這一結(jié)果與Wang等的研究結(jié)果“用60Co-γ射線輻射處理德國鳶尾種子會(huì)縮短植株的葉長”不一致，這可能與不同植物、不同品種對(duì)輻射的敏感性存在差異［23］有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，60Co-γ輻射對(duì)卷丹百合花瓣色澤的影響不大，只有4 Gy劑量輻射處理以及4 Gy+0.1%秋水仙素處理的花瓣花色苷、類黃酮含量與對(duì)照差異顯著。這可能是因?yàn)?0Co-γ射線和秋水仙素共同作用激發(fā)了卷丹百合體內(nèi)潛在的保護(hù)機(jī)制，很多類黃酮物質(zhì)都具有強(qiáng)抗氧化活性［24-25］。葉綠素是捕獲光能的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量可以在一定程度上反映植物同化物質(zhì)的能力［26］。查錢慧等［27］對(duì)南山茶增城1號(hào)進(jìn)行60Co-γ輻照處理，發(fā)現(xiàn)在20 Gy和30 Gy輻照處理下的葉綠素含量高于對(duì)照。有研究表明海州常山的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量均隨著輻照劑量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。在本研究中，60Co-γ射線3 Gy輻射處理和3 Gy+0.1%秋水仙素處理使卷丹百合的葉色呈深綠色，葉綠素a含量較對(duì)照顯著提高了21.2%，這與前人的研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射及輻射結(jié)合秋水仙素處理對(duì)卷丹百合鱗莖主要營養(yǎng)保健成分產(chǎn)生了不同程度的影響，主要表現(xiàn)在水分、多酚及類黃酮含量的顯著變化上，而多糖含量變化不大，這與李彥杰等［28］的研究結(jié)果“輻照可引起多糖降解”不一致，這可能與多糖檢測(cè)本身存在不穩(wěn)定性有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：60Co-γ射線及60Co-γ射線結(jié)合秋水仙素處理卷丹百合鱗莖的致死劑量為5 Gy，適宜輻照劑量為2~3 Gy。經(jīng)輻照處理后，卷丹百合植株的生長受到了比較明顯的抑制，其中4 Gy處理使卷丹百合頂端生長珠芽，不開花；3 Gy處理使葉片葉綠素a含量增加，葉片葉色濃綠；3 Gy及3 Gy+0.1%秋水仙素處理使卷丹百合新鱗莖的水分及多酚含量增加。本試驗(yàn)結(jié)果可為今后卷丹百合的誘變育種提供理論依據(jù)。