對(duì)葉榕果實(shí)對(duì)蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物的影響

張笑穎， 鄒潔建， 肖嘉杰， 陸宇燕， 李丕鵬， 古河祥， 楊光大， 侯方暉， 王雪謙

(1. 沈陽(yáng)師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽(yáng)110034； 2. 廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心，廣州510000；3. 沈陽(yáng)市兒童醫(yī)院，沈陽(yáng)110033)

腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)在對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)攝入、疾病發(fā)生、免疫力調(diào)節(jié)等方面的作用已被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可，并成為近10年來(lái)的研究熱點(diǎn)(高權(quán)新等，2010；Hill & Artis, 2010；周建設(shè)等，2018)。影響腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的因素有3個(gè)：遺傳、生存環(huán)境和飲食(張家超，2014)。趙佩華(2016)指出，遺傳因素決定了菌群的組成成分，即有無(wú)的問(wèn)題，而環(huán)境和飲食則對(duì)菌群各組成成分的數(shù)量起重要作用。腸道菌群對(duì)飲食組分變化的響應(yīng)極其快速，并在飲食穩(wěn)定后趨于動(dòng)態(tài)平衡(David.，2014；張晶等，2015)。但這方面的研究目前集中在哺乳動(dòng)物，尤其是人類(lèi)。爬行動(dòng)物腸道微生物對(duì)飲食變化的響應(yīng)僅見(jiàn)對(duì)分布在不同飼養(yǎng)場(chǎng)鱷蜥泄殖腔樣本的研究，分別投喂蚯蚓和泥鰍的2組樣本的腸道菌群存在顯著差異(Jiang.，2017)。

蘇卡達(dá)陸龜是中非陸龜屬唯一種，分布于非洲中部，是世界第三大陸龜，常棲息于沙漠周邊或熱帶草原等開(kāi)闊干燥地帶。雜食性，以植物為主要食物。人工飼養(yǎng)條件下喜食各種瓜果、蔬菜、牧草、桑葉等，可投喂少量牛肉、黃粉蟲(chóng)等動(dòng)物性食物(周婷，周峰婷，2020)。對(duì)葉榕為?？芃oraceace榕屬聚果榕亞屬subgen.植物，葉和花序內(nèi)含有多種化學(xué)成分，其中花序含有β-欖香烯、β-芹子烯和α-依蘭油烯等(朱兆云，韋群輝，2010)。本文對(duì)1組體長(zhǎng)相近的蘇卡達(dá)陸龜自主取食對(duì)葉榕果實(shí)前后的糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA高通量測(cè)序分析，旨在探究不同飲食組成成分對(duì)糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，并對(duì)其進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)的分析。旨在為蘇卡達(dá)陸龜糞便菌群多樣性研究積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本實(shí)驗(yàn)在廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心完成，選取在中心飼養(yǎng)半年以上的7只蘇卡達(dá)陸龜，體長(zhǎng)10～20 cm，日常以龜飼料(主要原料為魚(yú)粉、植物蛋白、維生素等)和應(yīng)季蔬果(番薯藤、油麥菜var.、闊葉豐花草、番木瓜、南瓜等)投喂。在對(duì)葉榕果實(shí)成熟高峰期，飼養(yǎng)區(qū)內(nèi)有大量的果實(shí)落入，蘇卡達(dá)陸龜會(huì)自由取食。觀察糞便發(fā)現(xiàn)，其中含有大量對(duì)葉榕種子。在果實(shí)成熟高峰期采集含有種子的糞便樣本(ZZ-A組)保存待檢測(cè)。在果實(shí)成熟后期，及時(shí)清理果實(shí)，常規(guī)飼養(yǎng)。在停止進(jìn)食果實(shí)近2個(gè)月后，再次采集糞便樣本作為對(duì)照組(ZC-A組)。采樣時(shí)僅選取新鮮糞便中心部分以保證樣本質(zhì)量。將樣本快速置于滅菌離心管內(nèi)，-20 ℃保存，送上海派森諾生物科技股份有限公司檢測(cè)。共采集2組 14份樣品(表1)。

表1 采集樣品編號(hào)Table 1 Number of collected samples

1.2 微生物多樣性分析

使用Illumina公司NovaSeqPE250測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA測(cè)序。1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)與質(zhì)量提取。采用Nanodrop紫外定量設(shè)備進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)。選擇rRNA基因可變區(qū)V3～V4基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶。PCR引物序列為：正向引物5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，反向引物3’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5’。擴(kuò)增體系25 μL：5 μL 5×反應(yīng)緩沖液，5 μL 5×GC緩沖液，2 μL 2.5 mmol·LdNTP，1 μL 10 μmol·L正向引物，1 μL 10 μmol·L反向引物，2 μL DNA模板，8.75 μL ddHO和0.25 μL Q5 DNA聚合酶。擴(kuò)增參數(shù)為：98 ℃ 5 min;98 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，25個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min，10 ℃保持。

采用QIIME2(2019.4)完成序列質(zhì)控、去噪、聚類(lèi)等步驟以及多樣性分析。應(yīng)用Alpha多樣性方法，通過(guò)Chao1、Observed species、Shannon、Simpson等4個(gè)指標(biāo)分析樣本物種多樣性和豐富度；使用Beta多樣性分析，通過(guò)基于weighted UniFrac的距離生成的主坐標(biāo)分析和基于bray_curtis距離生成的層次聚類(lèi)分析評(píng)價(jià)樣本組間差異。利用Python LEfSe包等進(jìn)行LEfSe分析，尋找分組之間穩(wěn)健的差異物種即標(biāo)志物種。采用Excel初步整理數(shù)據(jù)，SPSS判斷部分?jǐn)?shù)據(jù)的方差齊性并進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。菌群名稱和分類(lèi)參考生物醫(yī)藥大辭典(https://lpsn.dsmz.de/)。

2 結(jié)果

2.1 微生物組成和結(jié)構(gòu)特征

通過(guò)QIIME2對(duì)糞便樣本進(jìn)行了測(cè)序分析，稀疏曲線顯示了ZZ-A組在測(cè)序深度為25 000時(shí)序列數(shù)基本穩(wěn)定，ZC-A組在測(cè)序深度為15 000時(shí)序列數(shù)基本穩(wěn)定，表明測(cè)序的數(shù)量已經(jīng)飽和，可以真實(shí)反映樣本菌群組成情況(圖1：A)。檢測(cè)樣品獲得了平均長(zhǎng)度為419.36 bp的842 940個(gè)高質(zhì)量序列，以100%相似度聚類(lèi)得到擴(kuò)增序列變體(amplicon sequence variants，ASVs)，2組樣本共享1 187個(gè)ASVs，ZZ-A組獨(dú)有6 974個(gè)，ZC-A組獨(dú)有7 374個(gè)(圖1：B)。

圖1 蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物的稀疏曲線圖(A)和ASV韋恩圖(B)Fig. 1 Rarefaction curve (A) and ASVs venn diagram (B) of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

全部樣本檢測(cè)到并注釋的微生物共包含 39門(mén)，2組中相對(duì)豐度均>1%的菌門(mén)共有6個(gè)：擬桿菌門(mén)Bacteroidetes、厚壁菌門(mén)Firmicutes、變形菌門(mén)Proteobacteria、互養(yǎng)菌門(mén)Synergistetes、疣微菌門(mén)Verrucomicrobia和螺旋體門(mén)Spirochaetes，其中擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，兩者相對(duì)豐度之和分別為ZZ-A組89.55%、ZC-A組77.15%(圖2)。2組間6門(mén)的相對(duì)豐度均無(wú)顯著性差異，ZZ-A組擬桿菌門(mén)和螺旋體門(mén)的相對(duì)豐度高于ZC-A組，其余4個(gè)菌門(mén)則反之。厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值(F/B)：ZZ-A組為0.42，ZC-A組為0.96，組間差異顯著(=0.047)。

圖2 蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物門(mén)水平排名前10門(mén)的相對(duì)豐度Fig. 2 Relative abundance of top 10 fecal microbial phylum levels in Centrochelys sulcata

屬級(jí)水平分析結(jié)果顯示，所檢測(cè)標(biāo)本中完成匹配的菌屬共有409個(gè)，相對(duì)豐度排名50位以后的菌屬以及未分類(lèi)物種占比極高，2組均超過(guò)75%。相對(duì)豐度>1%的菌屬，ZZ-A組有3個(gè)：梭菌屬、密螺旋體屬和擬桿菌屬，它們的平均相對(duì)豐度均高于ZC-A組，其中擬桿菌屬的組間差異顯著(=0.03);ZC-A組有5個(gè):普雷沃氏菌屬、氨基酸球菌屬、菌屬、菌屬和密螺旋體屬，前 4個(gè)菌屬的平均相對(duì)豐度均高于ZZ-A組，且均有顯著性差異(普雷沃氏菌屬：=0.02，氨基酸球菌屬:=0.04,菌屬:=0.02,菌屬:=0.007)。

2.2 微生物多樣性分析及其差異

Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)顯示，2組樣本在Chao1(=0064)、Observed species(=0570)、Shannon(=0570)及Simpson(=0480)4個(gè)指數(shù)上均無(wú)顯著性差異(圖3)。基于weighted UniFrac的距離生成的主坐標(biāo)分析顯示：ZZ-A組中 5個(gè)樣本和ZC-A組相互分離，另外有 2個(gè)樣本與本組相距較遠(yuǎn)，而與ZC-A組相近(圖4：A)。提示提供這 2個(gè)糞便樣本的龜可能由于某些原因在進(jìn)食對(duì)葉榕果實(shí)的頻度或數(shù)量上與其他龜存在一定的差別?；赽ray_curtis距離生成的層次聚類(lèi)分析顯示，2組樣本各自聚集在一起，呈現(xiàn)出良好的區(qū)分(圖4：B)。

圖3 蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物Alpha多樣性分析Fig. 3 Alpha diversity analysis of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

圖4 蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物的主坐標(biāo)分析圖(A)和層次聚類(lèi)樹(shù)(B)Fig. 4 Principal co-ordinate analysis (A) and hierarchical clustering tree (B) of Centrochelys sulcata fecal microorganisms

LEfSe分析結(jié)果顯示，在互養(yǎng)菌門(mén)、疣微菌門(mén)、變形菌門(mén)中僅含有ZC-A組的標(biāo)志物種，包括互養(yǎng)菌門(mén)的Synergistaceae菌科、疣微菌門(mén)的RFP12菌科、變形菌門(mén)的Betaproteobacteria綱；在擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)中，2組樣本的標(biāo)志物種不同：ZZ-A組以擬桿菌門(mén)的擬桿菌目Bacteroidales、厚壁菌門(mén)的梭菌屬為標(biāo)志物種，ZC-A組以擬桿菌門(mén)的理研菌科Rikenellaceae、普雷沃氏菌屬和菌屬，厚壁菌門(mén)的Lactobacillales菌目、Mogibacteriaceae菌科、瘤胃球菌科Ruminococcaceae和菌屬為標(biāo)志物種(圖5)。

圖5 蘇卡達(dá)陸龜糞便微生物L(fēng)EfSe分析的分類(lèi)學(xué)分支圖Fig. 5 Cladogram of Centrochelys sulcata fecal microorganisms based on LEfSe analysis

2.3 功能預(yù)測(cè)分析

將2組糞便微生物菌群的ASVs與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)核心生物代謝通路分析數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，注釋后得到的KEGG代謝通路預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：共涉及6條一級(jí)生物代謝通路、33條二級(jí)代謝通路子功能以及181條三級(jí)代謝通路。在存在顯著性差異的14條三級(jí)代謝通路中，13條在相關(guān)功能的菌群相對(duì)豐度上呈現(xiàn)為：ZZ-A組>ZC-A組(表2)。其中，四環(huán)素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成和乙基苯的降解代謝通路在ZC-A組的豐度值為0，而在ZZ-A組最高可達(dá)338.96，在雙酚的降解、阿特拉津的降解和多環(huán)芳烴的降解和甜菜素的生物合成代謝通路中，ZZ-A組均高出ZC-A組 5倍以上。

表2 組間存在顯著性差異的代謝通路Table 2 Metabolic pathways that differed significantly between groups

3 討論

3.1 糞便微生物多樣性的變化

由于食物表面攜帶有未知菌群以及食物所含物質(zhì)及其在機(jī)體中代謝產(chǎn)生的物質(zhì)均對(duì)腸道菌群有著不可忽略的作用，因此食物組分的改變對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變備受關(guān)注(韓翔宇等，2021)。觀察投喂不同飼料的草魚(yú)發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在改變飼料組成的初期出現(xiàn)顯著變化，且在11 d后菌群結(jié)構(gòu)達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡(郝耀彤等，2015)。在以豆粕替代魚(yú)粉喂養(yǎng)牛蛙()和分別喂食蚯蚓和泥鰍的鱷蜥的研究表明，飲食的改變可以使腸道菌群的豐度發(fā)生變化(Jiang.，2017；丁李，2019)。本研究中ZZ-A組和ZC-A組的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯變化，2組取材時(shí)間僅間隔了2個(gè)月左右，證明了蘇卡達(dá)陸龜腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)食物組分變化具有快速調(diào)整的能力。

3.2 糞便微生物功能預(yù)測(cè)

生活環(huán)境中，無(wú)論是空氣、水域、土壤中，還是食物表面均有大量的菌群存在，它們隨著飲水和進(jìn)食進(jìn)入胃腸道，并在其中生長(zhǎng)繁殖，它們自身及其代謝產(chǎn)物不同程度地影響著有機(jī)體胃腸道的健康，甚至通過(guò)腦腸軸參與機(jī)體各個(gè)器官功能(趙軒等，2019)。對(duì)于進(jìn)入胃腸道的菌群，按照它們對(duì)機(jī)體的影響可劃分為有益菌、致病菌和條件致病菌(臧海軍，張克英，2007)。一些細(xì)菌在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，尤其是丁酸及丁酸鹽類(lèi)物質(zhì)對(duì)保持腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有不可忽視的貢獻(xiàn)，同時(shí)也是腸道上皮的主要能量來(lái)源之一(張家超，2014)。而更有研究證明腸道菌群的健康與人體的肥胖、心腦血管疾病甚至是中樞神經(jīng)疾病均有密切的關(guān)聯(lián)(李莎等，2021)。另外，由于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，一些具有“三致”特性的物質(zhì)，如乙基苯和多環(huán)芳烴，一些具有“環(huán)境類(lèi)激素”的物質(zhì)，如雙酚類(lèi)和阿特拉津等在環(huán)境中超標(biāo)，嚴(yán)重影響了有機(jī)體的健康(王小存，2007；張海峰，2007；董靜等，2021；曾超怡等，2021)。機(jī)體內(nèi)部的氧化和抗氧化平衡是維護(hù)細(xì)胞健康和功能正常的關(guān)鍵，但由于環(huán)境污染和藥物使用量的不適當(dāng)以及各種生理和心理的失調(diào)，均會(huì)增加機(jī)體內(nèi)部自由基，影響氧化和抗氧化平衡的維持，繼而造成細(xì)胞受損和加速衰老進(jìn)程(李晨等，2021)。

本研究的功能預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)進(jìn)食了對(duì)葉榕果實(shí)的蘇卡達(dá)陸龜糞便菌群在四環(huán)素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成、乙基苯的降解、雙酚的降解、阿特拉津的降解和多環(huán)芳烴的降解以及甜菜素的生物合成等代謝通路上的富集呈現(xiàn)出了與對(duì)照組極顯著的差異，個(gè)別甚至是從無(wú)到有(四環(huán)素的生物合成、聚酮體糖單元的生物合成、乙基苯的降解)。但是這些代謝通路的富集原因以及是否可以表達(dá)相關(guān)功能進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)還需要深入研究。

感謝廣東省野生動(dòng)物監(jiān)測(cè)救護(hù)中心徐錦興、毛學(xué)群、成鑒榮和梁穎琳在動(dòng)物飼養(yǎng)和取材中的幫助。