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    滋腎活血方聯(lián)合低分子肝素改善小鼠復發(fā)性流產(chǎn)及對VEGF/VEGFR-2/p-ERK/ERK 信號通路的影響

    2022-05-23 12:53:22葉佳敏葉利群張曉芳
    關(guān)鍵詞:小鼠劑量

    葉佳敏 葉利群 張曉芳 楊 脂 沈 穎

    復發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)又稱習慣性流產(chǎn),指妊娠不滿28 周的胎兒丟失且連續(xù)發(fā)生3 次或3 次以上,該病病因復雜,機制尚不明確,可能與子宮解剖、內(nèi)分泌、胚胎染色體、免疫等多種因素有關(guān)[1-2]。RSA 屬于中醫(yī)學“滑胎”范疇,古今名醫(yī)闡述其病因病機不外乎腎虛與血瘀,這與現(xiàn)代醫(yī)學對RSA 病理性變化的認識是一致的[3]。據(jù)相關(guān)文獻闡述,胎盤血管機能異常是導致RSA 發(fā)生的最主要病理變化[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是治療本病潛在的作用點,VEGF 高表達能夠改善血管重構(gòu),促使內(nèi)膜蛻膜化,最終使胚胎成功植入同時維持妊娠[5-6]。相關(guān)研究已證實低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)能提高復發(fā)性流產(chǎn)患者VEGF 的表達[7]。前期臨床觀察結(jié)果顯示,與單一LMWH 相比,滋腎活血方聯(lián)合LMWH 有效改善RSA 患者的妊娠結(jié)果[8]。本實驗通過滋腎活血方聯(lián)合LMWH 干預RSA 模型小鼠,驗證該法治療RSA 的效果,進一步探討其對VEGF 蛋白介導的信號通路的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 68 只未孕CBA/J 雌鼠,26 只DBA/2雄鼠,8 只BALB/c 雄鼠,SPF 級,體質(zhì)量(20±2)g,鼠齡(7±1)周,購買自北京華阜康生物科技公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2020-0004。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心,室內(nèi)濕度(50±10)%,室內(nèi)溫度(23±2)℃,適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究獲浙江動物倫理委員會批準同意,批件編號:20201019-19。

    1.2 實驗用藥及其藥物組成 滋腎活血方:菟絲子、川斷、鹽杜仲、炒黨參、炒谷芽、炒白芍、丹參各15g,炒白術(shù)、茯苓、當歸各10g,炙甘草6g,三七粉3g,由寧波市中醫(yī)院中藥房煎煮濃縮后備用。煎煮法:用1000mL 純凈水浸泡中藥,先煮沸30min,倒出藥液,按上述方法再次煎藥,將2 次煎藥液混合并減壓濃縮至濃度為2.5g/mL,放置于-10℃冰箱,臨用時加入純凈水稀釋至所需濃度。那屈肝素鈣注射液(0.4mL/4100IUXa 因子,葛蘭素史克有限公司)。

    1.3 主要試劑與儀器 主要試劑:DAB 試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司,批號ZLI-9017);BCA 試劑盒(凱基生物,批號KGP902);全蛋白提取試劑盒(凱基生物,批號KGP2100);Tris-EDTA(pH9.0)抗原修復液(上海源葉生物科技有限公司,批號R20904);免疫組化通用型二抗(北京中杉金橋生物有限公司,批號PV-9001);兔單克隆VEGF 抗體(Abcam,批號ab214424);兔單克隆VEGF Receptor 2 抗體(Cell Signaling Technology,批號9698s);兔單克隆ERK 抗體(Cell Signaling Technology,批號4370t);兔單克隆P-ERK 抗體(Cell Signaling Technology,批號4695t);硝酸纖維素膜(Millipore,批號HATF00010)等。

    主要儀器:冰凍切片機(Leica 公司,型號Leica CM 1950),隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海甘易公司,型號GNP-9270A),數(shù)字切片掃描儀(濱松光子公司,型號NanoZoomer),Odyssey 成像系統(tǒng)(美國LI-COR 公司,型號Odyssey CLx),電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(美國BIO-RAD 公司,型號mini-PROTEAN、PowerPac),冷凍高速離心機(美國Thermo 公司,型號Fresco 17),制冰機(Panasonic 公司,型號SIM-F140AY65-PC)等。

    1.4 造 模 進行適應性喂養(yǎng)7 天后,按雌∶雄=2∶1,每夜將CBA/J 雌鼠分別與DBA/2 雄鼠及BALB/c 雄鼠同籠交配。依據(jù)文獻[9]的經(jīng)典方法,將流產(chǎn)率僅有5%~10%的CBA/J×BALB/c 交配方式作為正常妊娠模型小鼠,流產(chǎn)率高達30%~40%,且具有隱形、反復性及父系特異性特征的CBA/J×DBA/2 交配方式作為反復流產(chǎn)小鼠模型。取雌鼠陰道分泌物制作成涂片,若檢出雌鼠有脫落的陰栓(乳白色、固態(tài)膠狀物)或鏡下發(fā)現(xiàn)含有大量精子的陰道涂片,則記為妊娠第0 天。

    1.5 分組與干預 將建模成功后的正常妊娠小鼠10 只作為正常對照組,RSA 模型小鼠50 只按隨機數(shù)字法分為模型組、LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組,每組10 只。

    從妊娠期第1d 開始,每日上午7 點給藥,通過人鼠等效劑量比值表(以人鼠體表面積折算)計算出用藥劑量[10],LMWH 組按1000U/kg 在小鼠腹腔內(nèi)注射;正常對照組及模型組灌胃等體積蒸餾水;滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組,中藥灌胃劑量分別為3.9、11.7、35.1g/kg,LMWH 與西藥組同劑量,給藥2 周。

    1.6 標本收集 末次給藥1d 后,每只小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1mL/100g),麻醉后用脊椎脫臼法處死,解剖并分離子宮,縱向剖開子宮,每只小鼠取4個不同部位的蛻膜組織固定在4%多聚甲醛液中,20min 后將組織內(nèi)含有水分脫去,用石蠟滲透進行包埋、制成切片備用。

    1.7 觀察指標

    1.7.1 小鼠流產(chǎn)率 觀察小鼠宮腔內(nèi)胚胎表現(xiàn),并計算胚胎丟失率。判斷依據(jù):正常胚胎(淡紅、均勻粗大似串珠),宮內(nèi)未有積血;流產(chǎn)胚胎局部顯露或全部丟失(黑褐、大小不均或竹節(jié)樣變),宮內(nèi)有大量積血。

    胚胎丟失率=流產(chǎn)胚胎數(shù)/(存活胚胎數(shù)+流產(chǎn)胚胎數(shù))×100%。

    1.7.2 免疫組化法檢測蛻膜組織中VEGF 表達 每組蛻膜組織切片脫蠟至水,加入3%H2O2靜置20min,PBS 液沖洗5min 后微波爐抗原修復,放置于10%山羊血清中密封處理0.5h,隔日PBS 液沖洗后滴入VEGF 一抗工作液(稀釋倍數(shù)為1∶100),36℃靜置1h,PBS 液沖洗5min,滴入生物素標記的二抗工作液,同等溫度下靜置0.5h,再次PBS 液沖洗5min,DAB 染色,復染,脫水,采用中性樹脂密封保存,借助光學顯微鏡,鏡下若有棕色或黃色的顆粒在細胞胞漿或胞核內(nèi)顯現(xiàn)則該反應陽性。用ImageJ 顯微圖象分析系統(tǒng),剖析同一視野下免疫反應陽性細胞的積分光密度(IOD)值,該值越大,提示蛋白表達越高。

    1.7.3 Western blot 測定VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關(guān)蛋白表達 每組蛻膜組織剪取約100mg,由液氮處理后,按照全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白。通過BCA 法對蛋白濃度進行測量,取離心后的上清液中總蛋白20μg,于10%SDS-PAGE電泳分離后移至硝酸纖維素膜上。將該膜置于含5%脫脂奶粉的PBS-T 中室溫封閉2h,然后分別加VEGF、p-ERK(稀釋倍數(shù)1∶1000),VEGFR-2、ERK抗體(稀釋倍數(shù)1∶500)一抗,4℃孵育,次日滴加TBST沖洗3 次,每次10min。用二抗稀釋液以1∶10000 稀釋辣根過氧化物酶封閉2h,再加TBST 沖洗3 次,每次10min。采用ImageJ 軟件定量蛋白灰度值,蛋白相對表達水平用目的蛋白與GAPDH 蛋白的灰度比值表示。

    1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差()表示,多組間比較用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t 方法,計數(shù)資料比較,采用χ2檢驗。按P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠胚胎丟失率 與正常對照組比較,模型組小鼠胚胎丟失率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組小鼠胚胎丟失率均明顯下降(P<0.05);與LMWH 組比較,滋腎活血方低劑量+LMWH 組小鼠胚胎丟失率下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組胚胎丟失率明顯下降(P<0.05),見表1。

    表1 各組小鼠胚胎丟失率比較

    2.2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 表達 免疫組化結(jié)果表明,與正常對照組比較,VEGF 蛋白平均IOD 值在模型組降低顯著(P<0.01);與模型組比較,該平均值在LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH組均有不同程度上升(P<0.05);與LMWH 組比,在滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組中該平均值均有不同程度上升,均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

    表2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 平均光密度比較()

    表2 各組小鼠蛻膜組織VEGF 平均光密度比較()

    注:正常對照組灌胃蒸餾水;模型組灌胃蒸餾水;LMWH 組腹腔內(nèi)按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方低劑量+LMWH 組按3.9g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方中劑量+LMWH組按11.7g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方高劑量+LMWH 組按35.1g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子;LMWH 為低分子肝素;與正常對照組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05;與LMWH 組比較,cP<0.05

    圖1 各組小鼠蛻膜組織VEGF 蛋白表達(免疫組化染色,×100)

    2.3 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關(guān)蛋白表達 Western blot 結(jié)果表明,與正常對照組比較,VEGF、VEGFR-2 蛋白在模型組降低(P<0.05);與模型組比較,VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白在LMWH 組、滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH 組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組均有不同程度上升(P<0.05);與LMWH 組相比,VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白在滋腎活血方低劑量+LMWH 組、滋腎活血方中劑量+LMWH組、滋腎活血方高劑量+LMWH 組均有不同程度上升,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

    圖2 各組小鼠蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 蛋白的表達

    表3 各組VEGF、VEGFR-2、ERK 與p-ERK 蛋白灰度值比較()

    表3 各組VEGF、VEGFR-2、ERK 與p-ERK 蛋白灰度值比較()

    注:正常對照組灌胃蒸餾水;模型組灌胃蒸餾水;LMWH 組腹腔內(nèi)按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方低劑量+LMWH 組按3.9g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方中劑量+LMWH 組按11.7g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;滋腎活血方高劑量+LMWH 組按35.1g/kg 灌胃滋腎活血方和按1000U/kg 注射LMWH;VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子;VEGFR-2 為血管內(nèi)皮生長因子受體2;p-ERK為磷酸化的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;ERK 為細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;LMWH 為低分子肝素;與正常對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與LMWH 組比較,cP<0.05

    3 討論

    隨著對RSA 病機的深入挖掘,大多數(shù)學者認為母胎界面脈管新生障礙是導致RSA 發(fā)生的重要因素[11]。從妊娠生理來看,胚胎的著床伴隨著子宮內(nèi)膜蛻膜化,在這變化中大量的血管生成與重塑使胚胎與子宮內(nèi)膜緊密結(jié)合,建立豐富的子宮-胎盤血管網(wǎng)以便母胎間物質(zhì)運輸,確保正常妊娠進行[12]。若胎盤組織中血管生成受阻,胚胎難以植入或使胎兒血供不足,皆為妊娠失敗,是目前RSA 重要發(fā)病機制。中醫(yī)認為,“滑胎”的病因病機以腎氣虛弱為本,瘀血停滯為標。腎主生殖,藏精,《女科經(jīng)綸》謂腎氣為“母之真氣”,“子所系”,故腎氣充盛乃維持正常妊娠及促進胎兒生長之根本。據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)·靈樞》載:“有所墜墮,惡血內(nèi)留”,可見瘀血為“墜墮”的重要影響因素。腎虛與血瘀貫穿于本病之始終,當以滋腎活血安胎為大法。

    清末醫(yī)家張錫純主張本病從腎論治,獨創(chuàng)壽胎丸防治滑胎,為補腎固沖安胎之劑,臨床屢獲效驗。滋腎活血方以壽胎丸為基礎,輔以活血、健脾之品,方中菟絲子為君藥,補腎固胎;續(xù)斷、杜仲補肝腎、通血脈、安胎元,兩藥助君補腎止漏安胎;黨參、炒白術(shù)、茯苓、炒谷芽、炙甘草補脾益胃,以后天生先天,充腎臟之精氣;白芍養(yǎng)血緩急;三七、當歸、丹參皆為活血祛瘀之品,合用活血之效倍增。在現(xiàn)代藥理學中,三七中的三七皂苷、當歸中的阿魏酸、丹參中的丹酚酸B 均有降低血液的黏稠度、減低血小板聚集及血栓生成,改善微循環(huán)的功能[13-15]。諸藥合用,補腎固沖,祛瘀生新,保證了胎盤及胎兒的血液供給,印證了《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“有故無殞,亦無殞也”之意。

    VEGF 是子宮血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子。有研究表明,VEGF 的血管新生作用與活血化瘀法之“生新脈”作用機制是一致的[16]。在妊娠早期,VEGF 的“生新脈”作用,可促進子宮內(nèi)母胎血管系統(tǒng)的形成,提高子宮內(nèi)膜容受性,促進胚胎著床[17]。所以提高VEGF 的水平成為改善RSA 患者母胎界面血管重構(gòu)的切入點。

    在本研究中發(fā)現(xiàn),滋腎活血方+LMWH 組較單用LMWH 組小鼠胚胎丟失率顯著降低,蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、p-ERK、ERK 通路相關(guān)蛋白表達明顯升高,通過本研究可以推測出滋腎活血方聯(lián)合LMWH 可通過VEGF 介導的信號通路改善RSA 小鼠妊娠結(jié)局。VEGFR-2 是VEGF 的特異性受體,它介導與血管生成有關(guān)的信號傳導優(yōu)于其它受體,是因其高酪氨酸激酶活性[18-19]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路位于VEGFR-2 的下游,共同參與子宮內(nèi)膜的血管生成。MAPK 家族里最重要的ERK,其磷酸化后形成的p-ERK 才具有活性,能夠促進某些基因的轉(zhuǎn)錄和表達[20]。VEGF 與VEGFR-2 相結(jié)合后,激活其下游的MAPK 信號通路(即PLC-γ-PKC-Raf-MEK-ERK 信號通路),p-ERK 被迅速地轉(zhuǎn)送到細胞核中去磷酸化并激活相應增殖反應的轉(zhuǎn)錄分子,調(diào)控細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄,促使血管內(nèi)皮細胞增殖,有利于胚胎植入子宮內(nèi)膜,形成良好母胎界面血管系統(tǒng),促進妊娠進程,最終影響胚胎發(fā)育[21]。

    綜上所述,滋腎活血方聯(lián)合LMWH 可上調(diào)RSA模型小鼠蛻膜組織VEGF 及VEGFR-2 的表達,這與激活VEGF/VEGFR-2/p-ERK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路密切相關(guān),本研究結(jié)果或為中西醫(yī)結(jié)合療法改善RSA患者妊娠結(jié)局提供實驗基礎。

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