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    山藥多糖的氨取代修飾和保潤性能研究

    2022-05-23 02:39:10白家峰熊亞妹劉遠(yuǎn)上孫懿巖劉紹華賈學(xué)偉許春平
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年8期
    關(guān)鍵詞:丙二醇煙絲去離子水

    白家峰,熊亞妹,劉遠(yuǎn)上,孫懿巖,劉紹華,賈學(xué)偉,許春平

    (1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,南寧 530001;2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450002;3.河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,石家莊 050000)

    山藥為薯蕷科薯蕷屬,為薯蕷屬植物地下塊莖。由于塊莖富含尿囊素、多糖、黏蛋白、各種維生素、皂苷和微量元素[1,2],具有降脂降壓、延緩衰老、強(qiáng)健脾胃、抑制腫瘤等功效[3-6],是藥食同源的植物[7],也是中國重要的出口特色蔬菜和保健品配料之一。

    對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾是目前多糖領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一[8]。采取有效的方法對(duì)多糖結(jié)構(gòu)修飾是增加其生物活性并促進(jìn)其生物活性呈現(xiàn)的有效方式。如欒芳[9]通過化學(xué)修飾的方法,引入季銨基團(tuán),結(jié)果表明,季銨基團(tuán)不僅能提高抗氧化能力,還能增強(qiáng)抑菌活性。季銨基團(tuán)增強(qiáng)了殼聚糖衍生物的正電荷密度,季銨基團(tuán)越多,活性越好。季銨基團(tuán)是抑菌活性提高的主要因素,季銨基團(tuán)越多,抑菌活性越好。季銨鹽化多糖具有良好的親水性、生物可降解性、生物相容性和抗菌活性等性能,在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[10]。

    目前從天然植物中提取多糖作為新型的保潤劑成為一個(gè)研究熱點(diǎn),相關(guān)報(bào)道表明這種新型保潤劑不僅使煙絲能夠保潤防潮,降低煙氣中的煙堿和焦油量,同時(shí)可以提高燃吸的感官質(zhì)量,增加香味[11]?,F(xiàn)在對(duì)天然植物多糖結(jié)構(gòu)修飾的研究較多,但未見對(duì)山藥多糖進(jìn)行氨取代以及氨取代山藥多糖的保潤性能的研究。本研究對(duì)懷山藥多糖進(jìn)行氨取代修飾,并將修飾前后的多糖加入煙絲中進(jìn)行保潤性研究,以期為研制出一種新型煙草保潤劑提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    材料:煙絲,河南中煙許昌卷煙廠;脫脂山藥粉,產(chǎn)自河南焦作懷山藥。

    試劑:α-淀粉酶、CH3I、H2O2、NaCl、NaBH4、KBr,天津市大茂化學(xué)試劑廠;NaOH,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氯仿,煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;正丁醇,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液,德州曼巴商貿(mào)有限公司;丙二醇,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;二甲基亞砜,鄭州艾克姆化工有限公司;纖維素酶,江蘇銳陽生物科技有限公司;BSTFA-TMCS(99∶1),東京化成工業(yè)株式會(huì)社。以上試劑均為分析純。D6-二甲基亞砜(99.9%),鄭州艾克姆化工有限公司,為色譜級(jí)。分子篩,上海麥克林生化有限公司。

    儀器:SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)、NB-DZF-6050真空干燥箱,鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;MSH280-Pro磁力攪拌機(jī)、Cence湘儀TDZ5-WS離心機(jī)、N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司;BINDER恒溫恒濕箱、ATY124電子天平,上海本熙測(cè)控設(shè)備科技有限公司;MB-1-1封閉式調(diào)溫加熱器,北京科偉永興儀器有限公司;DHG-914385-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Nicolet5700傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR),美國布魯克海文儀器公司;尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光聯(lián)用儀(SEC/MALLS/RI),美國懷亞特技術(shù)公司;UV-17001C紫外分光光度計(jì),上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 山藥多糖的提取取經(jīng)乙酸乙酯脫脂過的山藥粉200 g,加入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)NaCl溶液4 000 mL,加熱至50~60℃浸提。攪拌24 h后加入0.25%α-淀粉酶10 g和0.05%纖維素酶2 g進(jìn)行酶解處理,調(diào)節(jié)溫度為50℃左右,磁力攪拌24 h,靜置3~4 h[12]。

    將上述得到的混合溶液進(jìn)行離心以完全分離渣和上清液,上清液加入比例為4∶1的氯仿與正丁醇,通過Sevage法[13]除蛋白,機(jī)械攪拌靜置離心,重復(fù)3次,合并上清液并過濾濃縮至500 mL。渣先后經(jīng)過0.03%NaBH4溶液和3%NaOH溶液共2 000 mL,0.05%NaBH4溶液和5%NaOH溶液共2 000 mL堿處理后,用醋酸中和,機(jī)械攪拌后靜置離心,過濾濃縮分離上清液。用H2O2除色素,透析7 d,濃縮后冷凍干燥得到山藥多糖。

    1.2.2 氨取代山藥多糖的制備稱取山藥多糖200 mg,加入0.5 mol/L NaOH溶液40 mL,磁力攪拌至多糖完全溶解。取(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液1 mL緩慢加入多糖溶液中,繼續(xù)在80℃水浴鍋中加熱攪拌8 h,透析7 d,濃縮后冷凍干燥得到氨取代山藥多糖。

    1.2.3 GC-MS單糖分析甲基化是一種可以測(cè)量多糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)分析方法,可以用于確定多糖中單糖殘基之間的連接位置。以下方法根據(jù)文獻(xiàn)[14]稍作修改。在N2保護(hù)下,將2.5 g NaH加入到25 mL DMSO中以獲得甲基化試劑(SMSM),通過在SMSM中使用CH3I將10 mg多糖甲基化3次,然后在去離子水中透析并冷凍干燥。通過FT-IR檢測(cè)甲基化多糖是否成功,然后加入2 mol/L三氟乙酸3 mL在120℃下水解6 h。用NaBH4還原部分甲基化的單糖,并用乙酸中和,然后在120℃下用乙酸酐乙酰化3 h。將樣品用氮?dú)獯蹈刹⑷芙庠贑HCl3中。最后通過0.22μm膜過濾。

    GC-MS條件[15]為:色譜柱為HP-5MS型彈性石英毛細(xì)管柱(30.0 m×250μm×0.25μm),進(jìn)樣量為1μL,采用程序升溫,初始溫度為80℃,保持2 min,以5℃/min的速度升溫至240℃,分流比1∶1。氦氣流速為1 mL/min,EI離子源70 eV,接口溫度和離子源溫度分別為200、240℃。

    1.2.4 紅外吸收光譜分析用分析天平分別稱量3 mg氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品,與一定量的KBr混合均勻壓成薄片,然后用FT-IR光譜儀在4 000~400 cm-1區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收值[16]。

    1.2.5 核磁共振波譜分析用分析天平稱量20 mg山藥多糖樣品,加入0.5 mL的D6-二甲基亞砜,配制成40 mg/mL溶液,在80℃條件下機(jī)械攪拌至溶解,靜置后進(jìn)行1HNMR、13CNMR測(cè)定[17]。所有化學(xué)位移的單位用ppm表示。

    1.2.6 光散射分析分別用分析天平精確稱量15 mg氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品。然后加入0.9%NaCl溶液5 mL,80℃下攪拌8 h至溶解。測(cè)試溫度25℃,進(jìn)樣量100μL,流速為0.4 mL/min。流動(dòng)相為0.02%NaN3和0.2%NaNO3水溶液,用Astra軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析[18]。

    1.2.7 保潤性能測(cè)試稱取煙絲4份,每份20 g放入托盤中,放入恒溫恒濕箱中,控制溫度為22℃,相對(duì)偏差在1℃左右,相對(duì)濕度為60%,相對(duì)偏差在2%左右,在48 h內(nèi)平衡煙草水分。之后分別稱取氨取代山藥多糖樣品和山藥多糖樣品0.02 g溶于1.98 mL的去離子水中,配制2 mL 1%的丙二醇溶液,量取2 mL去離子水,將這4種溶液分別裝入噴壺,均勻地噴灑在煙絲上;放入恒溫恒濕箱中調(diào)節(jié)溫度為22℃,相對(duì)偏差在1℃左右,濕度為60%,相對(duì)偏差在2%左右,平衡水分。平衡48 h后將托盤取出分別稱量質(zhì)量3次,取平均值記為m0;然后再放回恒溫恒濕箱中,溫度調(diào)為22℃,相對(duì)偏差在1℃左右,濕度為40%,相對(duì)偏差在2%左右,每隔6 h稱量煙絲質(zhì)量,計(jì)為m1,直至煙絲質(zhì)量基本保持不變;然后將煙絲置于烘箱中,調(diào)節(jié)溫度為105℃,烘至煙絲的質(zhì)量基本沒有變化[19],經(jīng)過冷卻后稱取干煙絲的質(zhì)量記為m。則煙絲的初始含水率(W0)為:

    樣品中的煙絲即時(shí)含水率(W)為:

    以時(shí)間為橫坐標(biāo),即時(shí)含水率為縱坐標(biāo)制作煙絲的保潤性能圖[20]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 山藥多糖的單糖分析

    通過從山藥中提取山藥多糖,共得到山藥多糖9.2 g,提取率為4.6%。甲基化用于分析單糖組成,由表1可知,在山藥多糖中檢測(cè)到糖鏈上殘基類型主要構(gòu)型為→4)-Glcp-(1→、→6)-Glcp-(1→、→6)-Galp-(1→、→3)-Manp-(1→、→2,3)-Manp-(1→和端基Glcp-(1→,除少量甘露糖(9.3%)和半乳糖(4.6%)外,山藥多糖主要由葡萄糖(86.1%)組成。糖鏈主鏈主要由→4)-Glcp-(1→組成,含有少量末端糖基Glcp-(1→,糖鏈支化點(diǎn)應(yīng)為→2,3)-Manp-(1→。

    表1 山藥多糖甲基化分析結(jié)果

    2.2 紅外光譜分析

    在多糖的結(jié)構(gòu)分析中,紅外光譜可以識(shí)別多糖官能團(tuán),進(jìn)行定性分析。圖1是山藥多糖及其氨基化修飾后的紅外光譜圖,在波數(shù)3 350 cm-1處有1個(gè)較寬的伸縮振動(dòng)峰,是多糖羥基O-H的伸縮振動(dòng)峰,C-H鍵在波數(shù)2 820 cm-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰。1 700 cm-1處的吸收峰是由羰基C=O伸縮振動(dòng)引起的。在波數(shù)1 050 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)強(qiáng)吸收峰,是典型的吡喃糖苷的吸收峰。在波數(shù)1 350~1 500 cm-1區(qū)域的峰可以看出,山藥多糖和氨取代山藥多糖光譜有明顯的差異,其中波數(shù)1 480 cm-1處是羥基與氨基結(jié)合基團(tuán)的特征吸收峰[8],這說明氨取代修飾成功。

    圖1 傅里葉紅外光譜

    2.3 核磁共振波譜分析

    核磁共振技術(shù)在研究糖鏈結(jié)構(gòu)中起重要作用,其可以提供諸如單糖構(gòu)型、糖苷鍵和與糖殘基的連接序列之類的信息,為分析多糖結(jié)構(gòu)提供最重要的數(shù)據(jù)?;谖墨I(xiàn)[21]可獲得部分NMR光譜(1H,13CNMR)特征峰的歸屬。山藥多糖的13CNMR如圖2所示,碳的化學(xué)位移見表2,在異頭碳區(qū)域,發(fā)現(xiàn)3個(gè)異頭碳信號(hào),依次標(biāo)記為C1、C1′和C1″,其化學(xué)位移分別為100.7、97.4和92.5 ppm。由于C4去屏蔽導(dǎo)致其信號(hào)向低場(chǎng)移動(dòng)大約9 ppm(C4信號(hào)從70 ppm移動(dòng)至79 ppm),通過一維核磁初步判斷山藥多糖是α-1,4結(jié)構(gòu)。

    表2 山藥多糖峰的化學(xué)位移

    圖2 山藥多糖的一維核磁碳譜

    對(duì)所有糖殘基的1H進(jìn)行歸屬,結(jié)果如圖3所示,在13C譜圖的異頭碳吸收峰中,在100.7 ppm處的峰響應(yīng)值較高,該異頭碳信號(hào)所對(duì)應(yīng)的異頭氫信號(hào)為5.1~5.2 ppm,表明糖殘基為典型的α構(gòu)型,結(jié)合前文“2.1”中分析結(jié)果,證明山藥多糖主鏈化學(xué)結(jié)構(gòu)為α-1,4-葡聚糖,與淀粉結(jié)構(gòu)類似。

    圖3 山藥多糖的一維核磁氫譜

    淀粉是各類植物儲(chǔ)存能量和養(yǎng)分的主要方式,山藥塊莖中含有大量的淀粉。淀粉有直鏈和支鏈淀粉兩大類,直鏈淀粉是D-葡萄糖基以α-(1,4)糖苷鍵連接的多糖鏈,支鏈淀粉分子中除有α-(1,4)糖苷鍵的糖鏈外,還有α-(1,6)糖苷鍵連接的分支。直鏈淀粉遇碘呈藍(lán)色,支鏈淀粉遇碘呈紫紅色。將8 g KI溶于100 mL去離子水中,待全部溶解后加入1 g I2,振蕩溶解制成KI-I2溶液,驗(yàn)證所提山藥多糖是否含有淀粉結(jié)構(gòu)。山藥多糖、提取多糖剩余的山藥渣和標(biāo)樣淀粉均以相同濃度(0.2 mg/mL)溶于水中,滴加KI-I2溶液后,結(jié)果如圖4所示。標(biāo)樣淀粉變藍(lán),山藥渣也變藍(lán),顏色略淺,說明山藥渣中含有淀粉結(jié)構(gòu);而所提山藥多糖仍保持無色透明溶液,結(jié)合單糖分析和核磁的結(jié)果,說明其主鏈一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)雖然類似淀粉,但是其側(cè)鏈和空間結(jié)構(gòu)與淀粉不同。

    圖4 淀粉、山藥渣和山藥多糖溶液滴加碘液后的顏色變化

    2.4 山藥多糖和氨取代山藥多糖的SEC/MALLS/RI分析

    山藥多糖的鏈構(gòu)象采用尺寸排阻色譜(SEC)-多角度光散射(MALLS)-示差折光儀(RI)分析,結(jié)果如圖5所示。根據(jù)山藥多糖經(jīng)SEC色譜柱后不同流出時(shí)間的示差和光散射信號(hào)圖,把圖分為3個(gè)區(qū)域,其中組分1可能為山藥多糖聚集體峰,組分2為多糖峰,組分3為溶劑峰。根據(jù)示差信號(hào)統(tǒng)計(jì),聚集體所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%,含量較少,但是其粒徑較大,因此光散射信號(hào)較強(qiáng)。采用Zimm圖擬合方法處理,得到不同組分的分子大小和均方根旋轉(zhuǎn)半徑,結(jié)果如表3所示。由表3可知,組分1相對(duì)分子質(zhì)量超過千萬,與示差檢測(cè)器結(jié)果結(jié)合可知,組分1應(yīng)有少量的山藥多糖聚集體。由于多糖具有多羥基結(jié)構(gòu),分子鏈又較大,因此易發(fā)生分子鏈直接相互纏結(jié),出現(xiàn)聚集體,因此多糖溶液常出現(xiàn)單體和聚集體共存的情況。另外M w/M n稱為多分散指數(shù),用于闡明聚合物(如多糖)相對(duì)分子質(zhì)量分布的寬度。Mw/M n的值越大,相對(duì)分子質(zhì)量分布越寬。山藥多糖多分散指數(shù)接近2,說明其分散程度較低,相對(duì)分子質(zhì)量較為均一。

    表3 山藥多糖和氨取代山藥多糖的相關(guān)分子參數(shù)

    圖5 山藥多糖SEC/MALLS/RI色譜

    通過測(cè)定不同相對(duì)分子質(zhì)量級(jí)分的Mw與Rw連續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn),并建立二者的函數(shù)關(guān)系,即Rw=K Mwα,指數(shù)α與在指定溶劑中大分子的形狀和構(gòu)象相關(guān),可用于判斷高分子在相應(yīng)溶液中的鏈構(gòu)象,其中l(wèi)ogK為y軸上截距,α為直線斜率,通過計(jì)算得出K值為-1.34,α值為0.66,接近0.50~0.60,證明高分子在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。采用SEC/MALLS/RI檢測(cè)得到山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.747×105g/mol,遠(yuǎn)大于氨取代山藥多糖摩爾質(zhì)量1.115×104g/mol,說明衍生化后,山藥多糖發(fā)生降解。另外經(jīng)過氨基化修飾后,多糖的多分散系數(shù)增加,摩爾質(zhì)量分布變寬,可能是因?yàn)榘被^程中,在NaOH的作用下發(fā)生了不均勻的降解所致。

    2.5 保潤性能研究分析

    在煙絲中分別添加1%丙二醇溶液、1%氨取代山藥多糖溶液、1%山藥多糖溶液和去離子水,放置恒溫恒濕箱中,測(cè)定煙絲的含水率。由圖6可知,丙二醇組的含水率為13.78%,山藥多糖組的含水率為13.77%,氨取代山藥多糖組的含水率為14.05%,去離子水組的含水率為13.62%。當(dāng)恒溫恒濕箱相對(duì)濕度調(diào)為40%時(shí),隨著時(shí)間的增加煙絲的含水率逐漸下降,但是丙二醇組和山藥多糖組的含水率均高于去離子水組,24 h后4組煙絲的含水率趨于穩(wěn)定。其中在前6 h內(nèi)4組煙絲含水率下降速率均很快,前18 h丙二醇組煙絲的含水率平均下降速率(0.19%/h)明顯小于氨取代山藥多糖組(0.22%/h)、山藥多糖組(0.23%/h)和去離子水組(0.22%/h)。最后趨于穩(wěn)定時(shí),丙二醇組煙絲的含水率為9.79%,相比于初始含水率下降了3.99個(gè)百分點(diǎn),氨取代山藥多糖組煙絲的含水率略低于丙二醇組,為9.66%,相比于初始含水率下降了4.39個(gè)百分點(diǎn),山藥多糖組煙絲的含水率是9.29%,相比于初始含水率下降了4.48個(gè)百分點(diǎn),煙絲的含水率最低的組是去離子水組,為8.74%,相比于初始含水率下降了4.88個(gè)百分點(diǎn)。因此可以得出,相對(duì)于去離子水組來說,添加一定濃度的丙二醇溶液和多糖(包括山藥多糖和氨取代山藥多糖)溶液都能在一定程度上減緩水分散發(fā)的速度。糖類之所以具有保潤效果可能是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中含有親水性的基團(tuán)羥基,通過與水分子作用產(chǎn)生氫鍵從而具有持水能力,可以捕獲空氣中的水分,還可以減少煙絲中的水分向空氣中的揮發(fā),因此可以維持煙絲中的水分含量處于穩(wěn)定水平。氨取代山藥多糖的保潤性能優(yōu)于山藥多糖是由于其結(jié)構(gòu)中含有氨基基團(tuán),因此吸濕能力強(qiáng)于山藥多糖。但是氨取代多糖和山藥多糖的保潤效果沒有傳統(tǒng)的保潤劑丙二醇好,原因可能是因?yàn)楸嫉奈鼭衲芰Ω鼜?qiáng)。

    圖6 山藥多糖和氨取代山藥多糖的含水率

    3 小結(jié)

    通過GC-MS法分析山藥多糖的單糖組成,結(jié)果表明,山藥多糖主要由葡萄糖(86.1%)、甘露糖(9.3%)、半乳糖(7.2%)組成。通過傅里葉紅外分析山藥多糖和氨取代山藥多糖的官能團(tuán),表明氨取代修飾成功。用SEC/MALLS/RI分析山藥多糖和氨取代山藥多糖的摩爾質(zhì)量及分子構(gòu)象,結(jié)果表明,山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.747×105g/mol,多分散系數(shù)為2.027,均方根旋轉(zhuǎn)半徑為119.5 nm,表明高分子在溶液中呈現(xiàn)無規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。氨取代山藥多糖的摩爾質(zhì)量為1.115×104g/mol,多分散系數(shù)為3.582。通過核磁共振波譜分析和GC-MS分析,山藥多糖組分主要為α-1,4-葡聚糖。山藥多糖和氨取代山藥多糖均具有一定的保潤性,且氨取代山藥多糖比山藥多糖保潤性更強(qiáng),但效果略低于丙二醇。

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