程序降溫儀冷凍法和液氮熏蒸法冷凍精子復蘇效果比較

何紅梅 余雄武 左奎 劉林燕 孫麗 李鳳瓊

摘要：目的：比較程序降溫儀冷凍法和液氮熏蒸法冷凍人類精子復蘇及復蘇24小時后運動能力的差異。方法：對來自本院男科實驗室50份精液標本分別應用程序降溫儀冷凍法和液氮熏蒸法分別進行冷凍保存，液氮熏蒸法使用1.8ml和0.5ml兩種冷凍載體。復蘇后的精子以及復蘇后24小時的精子分別比較前向運動精子百分率（a+b級）%、快速前向精子百分率a%及曲線速率（VCL）、直線速率（VSL）、平均路徑速率（VAP）等參數(shù)。結(jié)果：應用程序降溫法冷凍精子復蘇后（a+b級）%、a%及VCL、VSL、VAP等參數(shù)與液氮熏蒸法兩種冷凍載體復蘇后的精子運動參數(shù)比較無顯著差異（ P>0.05）。程序冷凍法復蘇后精子經(jīng)上游處理24小時后前向運動精子百分率（a+b級）%、快速前向精子百分率（a級）%、VCL、VSL、VAP等參數(shù)與液氮熏蒸法各組參數(shù)比較無顯著性差異（P>0.05） 。結(jié)論：液氮熏蒸法冷凍人類精液在存活率和運動能力等方面不遜于程序降溫儀冷凍法，兩者均適于人類精液的冷凍保存。

關鍵詞：精液保存;程序冷凍法;液氮熏蒸法;上游法。

部分不孕患者在實施體外授精胚胎移植（in vitro fertilization，IVF）過程中可能會出現(xiàn)取精極度困難或因個人因素（如女方取卵當日男方無法來醫(yī)院取精的情況），對于這部分男性患者，提前冷凍保存一份精液可以作為取精日的備用選擇。程序冷凍法、液氮熏蒸法是常見的用于人類精液冷凍保存的兩種方法。這兩種方法在精液冷凍復蘇過程中，都可能會形成冰晶，而冰晶形成過大或過多會不可避免地損傷精子結(jié)構，影響精子的功能[1]，這會影響復蘇后精子的存活率和運動能力，而精液冷凍復蘇后的活率及運動能力是決定成功受精乃至臨床妊娠的重要因素[2]。為了比較程序冷凍法、液氮熏蒸法冷凍保存人類精子的效果，我們對2019年1月至2021年12月間在我院治療不孕患者的50份精液標本分別進行了兩種方法的冷凍保存，并比較了復蘇后及復蘇上游處理24小時兩組的差異，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料：精液標本均來自本院生殖中心男科實驗室的患者，共50份，所有用于研究的精液標本均已征得患者知情同意。精液質(zhì)量分析按照WHO《人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》（ 第4版）進行精液常規(guī)分析。標本納入標準：患者年齡25-40歲，精液量≥2ml，精子密度≥50%，存活率≥50%，禁欲時間控制在2～7天。通過手淫法收集精液于無毒、無菌取精杯中，待精液液化后，充分混勻，用定量移液器吸取10μl精液標本置于makler精子計數(shù)板（以色列）上，使用SSA-Ⅱ型計算機自動檢測分析系統(tǒng)（computeraided sperm analysis ，CASA，北京穗加） 依據(jù)WHO《第四版人類精液檢查和處理實驗室手冊》標準對精液進行分析，檢測精子的運動參數(shù)，包括前向運動精子（a+b級）%，快速前向運動精子a%及VCL、VSL、VAP。

1.1 方法

1.2 分組：將精液標本與精子冷凍保護劑（Nidacon，澳大利亞）按3：1比例緩慢混勻，然后根據(jù)冷凍方法的不同分為2組：A組程序降溫儀冷凍法，B組液氮熏蒸冷凍法。程序降溫儀冷凍法使用的載體為0.5ml麥管（CBS，法國），內(nèi)含冷凍精液體積為0.4ml;液氮熏蒸冷凍法根據(jù)使用不同的冷凍載體分為2組：B1組使用0.5ml麥管，B2組使用1.8ml凍存管（Thermo Scientific，美國），內(nèi)含冷凍精液體積分別為0.4ml和1.2ml。

1.3 精子冷凍及復蘇

1.3.1程序降溫儀冷凍精液：將裝有冷凍精液的0.5ml麥管放入程序化冷凍儀（Cl-8800i，澳大利亞）后，按照預設的降溫曲線逐步降溫，降溫結(jié)束后投入液氮。降溫曲線設定為：室溫23℃降至5℃，1℃ /min，5℃停留5分鐘，之后4℃降至-10.0℃，4℃ /min ，-10.0℃停留2分鐘，之后-6.0℃降至-80℃，6.0℃ /min，投入液氮。

1.3.2液氮熏蒸法冷凍精液：將裝有冷凍精液的0.5ml麥管和1.8ml凍存管按以下的步驟進行冷凍：液氮面上方15cm 處停留15分鐘，之后在液氮面上方5cm 處停留5分鐘 ，最后浸入液氮中。

1.3.3精液復蘇及計數(shù)：

1.3.3.1 0.5ml麥管的復蘇：從液氮罐中取出冷凍載桿，擦掉外表面的霜，置于37℃恒溫水浴箱中1分鐘。擦干麥管，剪開封口，用注射器吹出載桿中精液至離心管中，避免產(chǎn)生氣泡?；靹蚝笥枚恳埔浩魑?0μl精液標本置于makler精子計數(shù)板上，使用CASASSA-Ⅱ型計算機自動檢測分析系統(tǒng)依據(jù)WHO《第四版人類精液檢查和處理實驗室手冊》標準對精液進行分析。每次分析至少200條以上的精子，重復2次，檢測精子運動參數(shù)：前向運動精子（a+b級）%，快速前向運動精子a%及VCL、VSL、VAP，并計算精子冷凍復蘇率= 冷凍后（a+b級）%/冷凍前（a+b級）%×100%。

1.3.3.2 1.8ml凍存管的復蘇： 將存有冷凍精子的1.8ml 凍存管從液氮中取出，擦去外表面的液氮，置于37℃水浴箱中孵育5分鐘。復蘇后的精液混勻后用定量移液器吸取10μl精液標本，置于makler精子計數(shù)板上，使用CASA對精液進行分析（同上）。

1.3.4 復蘇精液上游處理：為保證A組和B復蘇精液的總體積相同以減少組間差異，0.5ml冷凍麥管需復蘇3管，1.8ml冷凍管復蘇1管，使兩組復蘇的精液總體積一致。采用上游法處理精液：將培養(yǎng)液與復蘇精液按照體積1：1混勻，500g 離心5分鐘。棄上清，沿管壁緩慢加入0.3ml G-mops plus，蓋緊管口，置于 37℃培養(yǎng)箱上游60分鐘。上游結(jié)束后用巴斯吸管小心吸取上層液體。調(diào)整精子終濃度為10～15*106/ml，取10μl精液標本置于makler精子計數(shù)板上，使用CASA對精液進行分析。剩余精子蓋緊后室溫中放置24小時。24小時后，混勻精子標本，取10μl標本置于makler精子計數(shù)板上，使用CASA檢測以下精子運動參數(shù)：（a+b級）%、a級精子%、以及VCL、VSL、VAP。

1.4 統(tǒng)計分析：本文所有數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料以（x±s） 表示，組間均數(shù)比較用Friedman秩和檢驗，兩兩比較用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2、結(jié)果

2.1 兩組復蘇后精子參數(shù)對比

程序降溫儀冷凍法（A組）和液氮熏蒸法（B組）兩組精液復蘇后的參數(shù)如表一，兩種冷凍方法以及使用不同冷凍載體冷凍精子的復蘇率、復蘇后（a+b級）精子百分率、a級精子百分率、VCL、VSL、VAP參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.2 經(jīng)上游處理24小時后精子參數(shù)對比

兩種冷凍方法以及使用不同冷凍載體冷凍精子復蘇后經(jīng)上游法處理，24小時后（a+b級）精子百分率、a級精子百分率、VCL、VSL、VAP參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

3 討論

人類精子在冷凍過程中不可避免地會受到一些物理和化學效應的影響，原因就在于降溫過程中產(chǎn)生的冰晶帶來的機械損傷及高滲透性帶來的化學損傷。不過，人類精子能夠耐受一定范圍內(nèi)的冷凍傷害，這可能與精子膜上磷脂、糖脂及固醇含量有關，而且因為精子內(nèi)水分含量較少（ 約為50%） ，精子比其它細胞更能耐受低溫導致的損傷【3】。

精子冷凍較常使用的是程序降溫儀冷凍法和液氮蒸汽熏蒸法。使用程序降溫法冷凍精子需要事先對程序降溫儀設定降溫曲線。最開始的時候降溫平緩，使精子逐步適應低溫環(huán)境，可減少冷休克的發(fā)生，然后相對快速的降溫，使得細胞外液滲透壓升高，水分從滲透壓低的內(nèi)液通過細胞膜流向滲透壓高的外液，于是精子細胞自身皺縮，逐漸完成脫水的過程，從而減少精子內(nèi)冰晶的發(fā)生。使用程序降溫儀冷凍精子控溫精確，是WHO推薦的精子冷凍方法[4]，缺點是需要專用程序化降溫儀設備，耗時較長，部分冷凍儀還受到冷凍載體的限制，無法大規(guī)模冷凍精液。而液氮熏蒸法比較簡單快捷，一次可以冷凍多管精液，如果測量液面高度統(tǒng)一，在幾個溫控的關鍵點降溫都比較合理，人為操作培訓得力，也是可以獲得穩(wěn)定、重復性好的結(jié)果。

無論使用哪種方法，復蘇后的精子都有一定的死亡比例。劉勇等認為熏蒸法解凍后精子活力及復蘇率得到顯著提高[5]，而李玉山等認為兩者復蘇效果沒有顯著差異，均可在人類精子冷凍獲得良好效果[6-7]。本研究的結(jié)果表明兩種冷凍方法解凍后的精子存活率及運動能力都沒有顯著差異，都獲得了較好的復蘇效果。不過，熏蒸法在緩慢降溫和快速降溫兩個階段的溫控仍然不及程序冷凍儀降溫過程中的精細，因此液氮熏蒸法仍需進一步完善實驗細節(jié)。

精子的前向運動率以及VCL、VSL、VAP等運動參數(shù)作為反應精子活力的有效指標，對男性不育的診斷和生育能力的評估具有一定的臨床意義[8]。精子是否較長時間維持快速有力的運動能力對后續(xù)的受精有著重要的意義，因此，本文比較24小時后程序降溫組和液氮熏蒸組復蘇精子活力的差異意在進一步評估冷凍對兩組精子活力的差異，結(jié)果顯示液氮熏蒸法在復蘇精子上游處理24小時后仍維持了較好的運動能力，同程序冷凍法比較差異是不顯著的，進一步說明熏蒸法冷凍復蘇后的精子也可以獲得較好的效果。當然，在人類精子冷凍原理和冷凍損傷領域，還需要更深入的研究以期得到更好、更穩(wěn)定的精子冷凍方法。

參考文獻：

[1]Watson PF. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawingfunction.Reprod，. Fertil Dev，1995，7（4）： 871-891.

[2]范立青、朱文兵、肖紅梅等。解凍后活動精子總數(shù)對他精人工授精妊娠率的影響研究[J]。《中國醫(yī)師雜志》2001年3卷9期 572-573，578頁

[3]熊承良，商學軍，劉繼紅主編. 人類精子學. 北京： 人民衛(wèi)生出版社，2013. 613-624.

[4]World Health Organization.WHO laboratory manual for theexamination and processing of human semen.5th ed.Geneva：WHO，2010.

[5] 劉勇，肖玉芳，趙東，施文博，盧慧，王如瑤，胡洪亮，李錚。人類精液一步熏蒸法凍融的實驗研究。中華男科學雜志 2012 年3 月 第18 卷 第3 期

[6] 李玉山，王全先，高學敏，等. 程序冷凍法、液氮熏蒸法冷凍人類精子的效果比較. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18 （ 9） ：1814-1815.

[7] 劉睿智，孫妍，許宗革，等. 速凍和緩慢冷凍法對精子運動特征的影響. 中國男科學雜志，2006，20（ 1） ： 8-10.

[8] 屈宗銀. 精子活力與精子運動參數(shù)關系的研究. 檢驗醫(yī)學與臨床，2009，6（23）： 1995-1996.

作者簡介：何紅梅（1978-），女，云南曲靖人，副主任醫(yī)師，從事輔助生殖臨床和科研工作

通訊作者：王艷玲，E-mail： wangnancy2013@163.com

基金項目：云南省生殖婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學中心（zx2019-01-01）;云南省生殖婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學中心開放課題（2019LCZXKF-SZ06）