高效液相色譜法測(cè)定綠茶中咖啡因的含量

曹志龍 楊建

摘要 目的：建立HPLC法快速測(cè)定綠茶中的咖啡因。方法：甲醇+水=75+25（v/v）; Waters 2696-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）;流速1.0ml/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9997）， 水浴加熱提取1.5h最佳。結(jié)論：用該方法測(cè)定茶葉中的咖啡因，操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞：咖啡因; HPLC; 茶葉; 含量分析

中國(guó)是茶的故鄉(xiāng)，制茶、飲茶已有幾千年歷史，名品薈萃，主要品種有綠茶、紅茶、烏龍茶、花茶、白茶、黃茶。茶葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用是與它的化學(xué)成分分不開(kāi)的。它的化學(xué)組成約有四百多種，其中對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥理作用關(guān)系比較密切的是多酚類(lèi)、生物堿和維生素[2 ]。茶葉中含一定量的咖啡因，咖啡因又稱咖啡堿， 化學(xué)名為1， 3， 7- 三甲基黃嘌呤， 溶于水、醇、氯仿、二氯甲烷等溶劑。它是一種中樞神經(jīng)興奮劑。一些人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)認(rèn)為咖啡因是一種較弱的致突變和致畸物， 還可引起局部缺血性心臟病， 心律不齊[3]。我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760- 86 規(guī)定，咖啡因的含量是飲料和茶葉中的一個(gè)重要品質(zhì)指標(biāo)， 其含量測(cè)定一直受到分析工作者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)對(duì)已經(jīng)提純的綠茶采用直接稀釋處理后，將待測(cè)液用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定[4]。

1、儀器與試藥

高效液相色譜儀：Waters 2696， UV檢測(cè)器：Waters 2487，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、在線脫氣裝置。色譜工作站：Millennium32。綠茶為市售，咖啡因?qū)φ掌罚ㄅ?hào)：200808，中國(guó)藥品生物制品檢定所）;甲醇（色譜純，美國(guó)天地公司）;實(shí)驗(yàn)用水均為純凈水。

2、方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18 （4.6×150）mm，5μm，大連依利特生產(chǎn)，流動(dòng)相：甲醇︰水=25︰75，測(cè)定波長(zhǎng)280nm， 柱溫：40℃，流速：1ml/min。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液 10μ L進(jìn)樣， 記錄色譜圖， 咖啡因峰的保留時(shí)間為6.730min，各峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，其后的雜質(zhì)峰分理論板數(shù)按咖啡因峰計(jì)算不低于 2000。供試品及對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖 1。

2.3 溶液制備

對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取干燥至恒重的咖啡因?qū)φ掌?mg于10ml量瓶中，加甲醇定容，制成1ml含咖啡因0.5mg/ml的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：裝好索氏提取裝置，精密稱取干燥茶葉粉末5.0g，置于卷好的濾紙?zhí)淄仓?，放入索氏提取器，在圓底燒瓶中加入50ml95%乙醇，水?。?5℃）加熱，連續(xù)提取約1.5h，抽濾，二次水洗滌濾渣，濾液轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，用二次水定容至刻度。搖勻，即為樣品儲(chǔ)備溶液。取樣品儲(chǔ)備液1ml于50ml量瓶中，即得。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍的考察

精密稱取咖啡因?qū)φ掌?，配置成濃度?.5mg/ml的溶液，作為貯備液。分別量取貯備液0.2ml，0.8ml，1.2ml，1.6ml，2.0ml置于10ml容量瓶，稀釋至刻度，得到濃度為10μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述系列濃度溶液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣，得系列濃度對(duì)應(yīng)峰面積和保留時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（X ）為橫坐標(biāo)， 色譜峰面積 （Y ）為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 其線性方程：Y=26661X-62352，相關(guān)系數(shù)：R=0.9999，表明咖啡因在10-100μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

吸取綠茶提取液樣品10μL注入液相色譜儀， 重復(fù)測(cè)定6 次， 峰面積RSD=0.7%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，6，12，24h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積RSD=2.4%，表明至少24h內(nèi)供試品溶液仍保持穩(wěn)定。

2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱量取 9份已知含量的同批樣品約2ml ，分別加入延胡索乙素對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6 ml各 3份， 按供試品溶液”制備方法制備后， HPLC測(cè)定， 記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 樣品測(cè)定： 取樣品 3批，按照供試品溶液制備方法操作后， HPLC 測(cè)定， 結(jié)果分別是35.70μg/ ml，35.56μg/ ml，34.96μg/ ml。

4 討論

4.1流動(dòng)相的選擇：本試驗(yàn)采用 HPLC法測(cè)定延胡索乙素的含量，采用甲醇- 水（體積比為 25： 75）為流動(dòng)相，咖啡因的保留時(shí)間為6.730min，且分離度和對(duì)稱性均良好。

4.2提取溶劑的選擇：本試驗(yàn)采用75%乙醇、95%乙醇提取，結(jié)果表明95%乙醇提取的樣品咖啡因含量高。

4.3提取時(shí)間的考察： 本試驗(yàn)采用1 h、1.5 h、3 h水浴加熱提取，結(jié)果表明水浴加熱提取1 h咖啡因含量低于1.5 h，而水浴加熱提取1.5h、3 h含量無(wú)差異，故選擇水浴加熱提取1.5h。

參考文獻(xiàn)：

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[3 ]汪必琴，鄭亞西.紫外分光光度法測(cè)定飲料、 巧克力和茶葉中咖啡因含量的研究[ J ] .四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2000， 23 （3） ： 309 - 311 .

[4 ]唐根源，吳紅京，吳棱，等.等度反相高效液相色譜法測(cè)定茶多酚中的兒茶素和咖啡因[J ].色譜， 2001， 19 （3） ： 233 - 235 .