實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用探討

張賀翠，馮 萍，李幫秀，薛雨飛，楊 昆，朱利泉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400715）

分子生物學(xué)是生物學(xué)的前沿與生長(zhǎng)點(diǎn)，是指從分子水平研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)，它同時(shí)是一門(mén)理論與實(shí)踐相結(jié)合的綜合性的新興學(xué)科[1]。分子生物學(xué)主要的研究領(lǐng)域是蛋白質(zhì)體系、蛋白質(zhì)-核酸體系（中心是分子遺傳學(xué))和蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體系（即生物膜），它目前是農(nóng)林院校生物專業(yè)和涉農(nóng)專業(yè)的重要課程，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域普遍運(yùn)用的方法和手段，實(shí)驗(yàn)課是一門(mén)讓學(xué)生理解、掌握分子生物學(xué)技術(shù)的課程[2]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種根據(jù)生物體內(nèi)DNA 半保留式復(fù)制的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的在體外對(duì)特定的DNA 序列放大擴(kuò)增的新技術(shù)。PCR 反應(yīng)最大的特點(diǎn)是將微量的DNA 進(jìn)行快速大幅度的擴(kuò)增，例如化石中的古生物，或者脫落許久的毛發(fā)甚至皮膚中只要有一點(diǎn)點(diǎn)DNA都可以通過(guò)PCR技術(shù)加以擴(kuò)增和放大，因此目前在分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科中得到廣泛的應(yīng)用[3]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)是在普通的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核算檢測(cè)技術(shù)[4]。qRT-PCR的基本原理是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[5]。由于qRT-PCR技術(shù)較常規(guī)PCR 技術(shù)相比，具有污染少、定量準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，qRT-PCR 技術(shù)在目前的科學(xué)研究中大量使用，經(jīng)常在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、作物育種、環(huán)境科學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中使用[6]。例如新冠肺炎病毒的核酸檢測(cè)，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)熒光信號(hào)累積確定是否有新型冠狀病毒，如果是帶有病毒的患者會(huì)檢測(cè)出熒光信號(hào)增強(qiáng)，這樣就可以顯示陽(yáng)性的結(jié)果。如果是核酸檢測(cè)沒(méi)有病毒的患者樣本，因?yàn)闆](méi)有靶基因的擴(kuò)增，就檢測(cè)不到熒光信號(hào)增強(qiáng)，這樣的結(jié)果就屬于新冠肺炎核酸檢測(cè)陰性[7]。NCBI 中可以搜索到的使用qRT-PCR 做基因表達(dá)分析的文章至少20 萬(wàn)篇，中國(guó)知網(wǎng)上收集的基因表達(dá)的文章至少2 萬(wàn)篇。例如西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院年均發(fā)表80 余篇與此相關(guān)的文章，其中水稻、油菜等科研團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)方面取得了一系列重大成果，其相關(guān)研究成果在Plant Cell、PNAS、Nucleic Acids Research等國(guó)際學(xué)術(shù)刊物發(fā)表。

但是由于購(gòu)買(mǎi)熒光定量PCR 儀成本高，維護(hù)費(fèi)用高，每個(gè)學(xué)生的使用成本在30元左右，限制了其在本科生教學(xué)中的使用，但是近年來(lái)，如何在本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中讓學(xué)生掌握以后的科研工作中常用的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，培養(yǎng)本科生的綜合能力和科研素養(yǎng)，促進(jìn)教學(xué)與科研的相互融合已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的重要方向[8]。因此，我們?cè)诒究粕慕虒W(xué)工作中初步進(jìn)行了不同氮肥施用量下團(tuán)棵期煙葉葉片中NtCIPK8的定量表達(dá)，并取得了較好的數(shù)據(jù)，讓本科生了解到環(huán)境因素也會(huì)影響基因的表達(dá)，由于進(jìn)行的qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)涉及到引物的設(shè)計(jì)、內(nèi)參基因的選擇、RNA 樣本制備及純化、反轉(zhuǎn)錄cDNA、相對(duì)定量法中內(nèi)參基因的校準(zhǔn)和樣品基因的定量檢測(cè)，掌握到這些基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 教學(xué)安排

1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析共計(jì)6個(gè)學(xué)時(shí)；2）實(shí)驗(yàn)分組：每2個(gè)學(xué)生一組；3）學(xué)生提前預(yù)習(xí)熒光定量PCR 的原理、實(shí)驗(yàn)方法、操作步驟及注意事項(xiàng)；4）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，課堂上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和討論，學(xué)生提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

材料：培養(yǎng)箱培養(yǎng)煙草植株到五葉一心期進(jìn)行移栽，設(shè)置純氮使用量75.0 kg·hm-2（T1）、90.0 kg·hm-2（T2）、105.0 kg·hm-2（CK） 112.5 kg·hm-2（T3）、120.0 kg·hm-2（T4）、135.0 kg·hm-2（T5）、150.0 kg·hm-2（T6）、165.0 kg·hm-2的8 個(gè)處理，其他施肥參照常規(guī)施肥方案進(jìn)行施肥，移栽后植株長(zhǎng)到團(tuán)棵期取葉片，液氮中凍存后放到-80 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

熒光定量PCR 儀定為BIO-Rad CFX Connect Real-Time PCR System，凝膠電泳裝置，微量核酸測(cè)定儀。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

使用RNA 植物提取試劑盒（天根）從8 個(gè)處理的葉片中提取RNA，并純化，利用高質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將純化后的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-Actin 為內(nèi)參基因擴(kuò)增NtCIPK8基因的表達(dá)量（見(jiàn)表1）。樣本每個(gè)處理重復(fù)3 次，反應(yīng)體系為20 μL：2 μL cDNA，上、下游引物各0.6 μL，SYBR10.4 μL，ddH2O 補(bǔ)齊20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，57 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算[9]。

表1 NtCIPK8和β-Actin的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮肥施用量的煙葉團(tuán)棵期葉片總RNA的提取

以8 個(gè)處理的煙葉葉片為材料，參照植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取煙葉葉片重的總RNA，通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其OD 值和濃度，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中所提取的葉片中RNA 純度（OD260/280）值均在1.8～2.1，表明RNA 純度較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

將提取的RNA 經(jīng)1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離，如圖1 所示，各RNA 條帶明亮而沒(méi)有降解，28S 和18S 條帶在亮度上接近2∶1，5S 條帶較暗，表明RNA 的純度和完整性較好，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

圖1 不同氮肥施用量的煙葉團(tuán)棵期葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 PCR產(chǎn)物的溶解曲線

從圖2、圖3 可知，內(nèi)參基因β-Actin 和8 個(gè)處理的煙葉葉片的NtCIPK8基因的溶解曲線均為單一峰，沒(méi)有其他峰的出現(xiàn)，同時(shí)圖3中的峰的形狀比較銳利，表明NtCIPK8基因在不同處理下的溶解溫度均一性比較好，同時(shí)表明PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性好，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

圖2 溶解曲線1

圖3 溶解曲線2

2.3 NtCIPK8基因擴(kuò)增曲線

圖4 的擴(kuò)增曲線分成了3 個(gè)階段，分別是熒光背景階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段及熒光信號(hào)擴(kuò)增平穩(wěn)期。基因擴(kuò)增曲線整體光滑且平穩(wěn)性較好，形狀“S”完整性好，符合熒光定量檢測(cè)的要求。

圖4 基因擴(kuò)增曲線

2.4 不同處理下煙葉團(tuán)棵期葉片中NtCIPK8表達(dá)量

圖5 結(jié)果表明：通過(guò)熒光定量PCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在不同處理下團(tuán)棵期的葉片中NtCIPK8均有表達(dá)，呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，不同處理后煙葉葉片團(tuán)棵期NtCIPK8的表達(dá)存在差異。其中在處理T3（純氮7.5 kg/667 m2）的葉片中NtCIPK8的表達(dá)量最高，處理T1（純氮5.0 kg/667 m2） 的葉片中NtCIPK8的表達(dá)量最低。

圖5 不同處理下團(tuán)棵期的葉片中NtCIPK8表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

學(xué)生們通過(guò)獨(dú)自提取RNA 并純化、反轉(zhuǎn)錄、使用熒光PCR 儀擴(kuò)增了8 個(gè)處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量，CIPKs 一類蛋白激酶家族，它是Ca2+感受器CBLs（Calcineurin B-like proteins，CBLs）的靶蛋白，CIPK與CBL 形成復(fù)合體[10]；Ca2+與CBL 結(jié)合后，CBLs 的構(gòu)型發(fā)生變化，它的疏水性結(jié)合位點(diǎn)暴露到外面，疏水性結(jié)合位點(diǎn)與CIPKs 的NAF 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使CIPKs釋放自抑制區(qū)，CBL/CIPK復(fù)合體被激活，從而調(diào)控細(xì)胞的代謝[11]。CIPK8 是CIPKs 的家族成員，它可能參與了植物的脅迫信號(hào)途徑[12]，同學(xué)們通過(guò)獨(dú)自提取RNA 并純化、反轉(zhuǎn)錄、使用熒光PCR 儀擴(kuò)增了8 個(gè)處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量，通過(guò)熒光定量PCR 擴(kuò)增了8 個(gè)處理下煙葉中NtCIPK8的表達(dá)量不僅使學(xué)生們掌握了實(shí)驗(yàn)技術(shù)，還了解了不同施氮量下相同組織中同一個(gè)基因的表達(dá)量也會(huì)不同，將基因表達(dá)的特點(diǎn)從一個(gè)抽象的概念轉(zhuǎn)化為了具體的數(shù)字圖形。

由于涉及到引物的設(shè)計(jì)、內(nèi)參基因的選擇、RNA 樣本制備及純化、反轉(zhuǎn)錄cDNA、相對(duì)定量法中內(nèi)參基因的校準(zhǔn)和樣品基因的定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，容易由于所使用的試劑及操作者的技術(shù)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大，甚至?xí)霈F(xiàn)失敗的現(xiàn)象[13]。其中qRT-PCR 的引物設(shè)計(jì)和內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要，引物設(shè)計(jì)過(guò)程中設(shè)計(jì)到引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增、退火溫度的選擇等，均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]；篩選到合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，可以給靶基因提供參考數(shù)據(jù)，同時(shí)可以消除因模板濃度不同帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。提取樣品RNA 的時(shí)候要特別注意RNA 的降解和污染，要使用無(wú)RNA 酶的器皿等。

本次實(shí)驗(yàn)是一次探索性的教學(xué)實(shí)驗(yàn)，由本科生為主體，老師作指導(dǎo)，綜合一系列實(shí)驗(yàn)而最終獲得結(jié)果，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究生做的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相一致，表明本科生通過(guò)提前預(yù)習(xí)、課堂講解、實(shí)際操作是可以達(dá)到較高的水平的，這里也顯示出實(shí)驗(yàn)整體設(shè)計(jì)的重要性，整個(gè)研究項(xiàng)目進(jìn)行合理的規(guī)劃設(shè)計(jì)就可以使得學(xué)生們?nèi)菀撞僮?，?shí)驗(yàn)誤差減少。

該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目具有較強(qiáng)的連貫性和綜合性，雖然實(shí)驗(yàn)成本較高，對(duì)學(xué)生的理論知識(shí)和操作技能也都有較為嚴(yán)格的要求，但是我們應(yīng)該以“雙一流”學(xué)科建設(shè)和“新農(nóng)科”人才培養(yǎng)為契機(jī)，以教育部《實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)》《專業(yè)實(shí)驗(yàn)室評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)》為標(biāo)準(zhǔn)，秉承傳授知識(shí)、培養(yǎng)能力、提高素質(zhì)的指導(dǎo)思想，緊緊圍繞提高本科教學(xué)質(zhì)量，建設(shè)高水平的農(nóng)學(xué)類、生物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)共享平臺(tái)；深化實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革和管理體制改革，構(gòu)建與專業(yè)人才培養(yǎng)目標(biāo)相適應(yīng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系，建立功能完善、結(jié)構(gòu)合理、管理高效的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行機(jī)制和管理體系；優(yōu)化實(shí)驗(yàn)隊(duì)伍結(jié)構(gòu)，提高實(shí)驗(yàn)教師專業(yè)技術(shù)水平，建立專兼職有機(jī)結(jié)合的高素質(zhì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)隊(duì)伍；遵循“高起點(diǎn)、新思路、有特色、重效用”的原則，突出重點(diǎn)、分期建設(shè)，加強(qiáng)中心信息化、設(shè)備更新、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室和實(shí)習(xí)基地等建設(shè)，夯實(shí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)在創(chuàng)新人才培養(yǎng)等方面的重要作用。

4 結(jié)語(yǔ)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)量可以讓學(xué)生快速地掌握基因表達(dá)檢測(cè)技術(shù)，數(shù)字、柱形圖等可以讓學(xué)生直觀地了解基因在器官和組織的表達(dá)狀況。提高本科生培養(yǎng)質(zhì)量，充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室在實(shí)踐和創(chuàng)新能力培養(yǎng)中的特殊作用，凸顯本科教育的特色，提高學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)技能，以實(shí)驗(yàn)教學(xué)來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)理論教學(xué)，同時(shí)能提高各專業(yè)學(xué)生解決具體問(wèn)題的能力，為培養(yǎng)本科生創(chuàng)新意識(shí)和開(kāi)展更深層次的研究工作打下良好的基礎(chǔ)。