CD226分子影響Treg細(xì)胞功能參與小鼠自身免疫性腦脊髓膜炎的發(fā)病

王 寧,徐 曦,姜朋濤,呂明華,胡志芳

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021;*通訊作者,E-mail:360308636@qq.com)

共刺激分子CD226組成性表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上,可介導(dǎo)T細(xì)胞亞群的分化和功能、NK細(xì)胞的殺傷、血小板的活化和聚集、單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附等[1],研究表明CD226參與了多種自身免疫性疾病發(fā)生過程中CD4+T細(xì)胞的激活過程[2]。Treg細(xì)胞是體內(nèi)重要的CD4+T細(xì)胞亞群,通過抑制效應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,在維持機(jī)體對(duì)外源性和內(nèi)源性抗原的免疫耐受中和穩(wěn)定機(jī)體免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡中具有重要作用[3],文獻(xiàn)報(bào)道自身免疫性疾病發(fā)生與Treg數(shù)量降低或功能的異常密切相關(guān)[4];Treg細(xì)胞高表達(dá)CD226分子,沉默CD226分子后可增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能[5]。

小鼠EAE模型是進(jìn)行人類多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)研究的經(jīng)典動(dòng)物模型,為典型的自身免疫性疾病[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)CD226多克隆抗體處理后對(duì)EAE的易感性降低[7],基于此,我們提出CD226是否通過對(duì)Treg細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用影響小鼠EAE發(fā)生發(fā)展的問題。為明確此問題,本研究利用野生型(wide type, WT)小鼠和CD226基因敲除(knockout, KO)小鼠構(gòu)建EAE疾病模型,觀察兩組小鼠病情變化,并探討CD226對(duì)EAE小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量、功能和細(xì)胞表面標(biāo)記分子表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)野生型C57BL/6背景小鼠,6～8周,體質(zhì)量為18～22 g,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF級(jí)純合子CD226 KO小鼠購(gòu)自南京大學(xué),將WT小鼠與KO小鼠合籠從而獲得CD226 KO F1代雜合子小鼠,隨后繼續(xù)在F1代小鼠間合籠以獲得F2代小鼠,通過鼠尾DNA基因鑒定篩選出CD226 KO小鼠為本實(shí)驗(yàn)所用,所有實(shí)驗(yàn)操作均已通過本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批(審批編號(hào):NO.XJYYLL-20144433)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建小鼠EAE模型 制備MOG35-55多肽抗原乳液,將6 mg熱滅活結(jié)核菌株H37RA溶解于2 ml弗氏完全佐劑中制備成混懸液,將上述兩種溶液冰浴研磨至油包水狀態(tài)備用。選取6～8周齡C57BL/6背景WT小鼠和KO小鼠各6只,0.5%戊巴比妥麻醉后,每只小鼠在腋窩和腹股溝皮下注射200 μl MOG35-55多肽抗原進(jìn)行免疫。在免疫當(dāng)天和第2天分別給予每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200 ng以破壞血腦屏障[8]。免疫后30 d內(nèi)每日進(jìn)行EAE疾病評(píng)分、稱量體質(zhì)量、觀察精神、進(jìn)食和活動(dòng)情況。EAE評(píng)分參考國(guó)際通用評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),無癥狀為0分;尾部癱瘓為1分;尾部張力完全消失且步態(tài)異常為2分;后肢瘸拐或部分癱瘓為3分;后肢完全癱瘓為4分;死亡為5分[9]。

1.2.2 分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞 脫頸處死小鼠,無菌條件下取出脾臟置于200目篩網(wǎng)上并剪碎,加入5 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液并進(jìn)行研磨,收集研磨液后在液面上緩慢加入0.5～1 ml RPMI 1640培養(yǎng)基,800g去剎車離心30 min后吸取白膜層細(xì)胞,加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min,重懸后300g離心5 min棄除上清,重復(fù)操作以充分洗滌細(xì)胞;細(xì)胞計(jì)數(shù)后待用。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)TGF-β和IL-10水平 Treg細(xì)胞通過分泌IL-10和TGF-β等抑制性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能[11],分選兩組小鼠EAE高峰期脾臟Treg細(xì)胞,anti-CD3/CD28(5 μg/ml)刺激3 d,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β水平。按照ELISA試劑操作指南稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,加入待檢樣品后放置于37 ℃水浴鍋40 min后洗板拍干,加入雙蒸水和一抗工作液后置于37 ℃水浴鍋中20 min,洗板后加酶標(biāo)抗體工作液并將反應(yīng)板置于37 ℃ 10 min,最后加入底物工作液100 μl,避光放置15 min后加入終止液100 μl,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)檢測(cè)樣品OD值計(jì)算出IL-10或TGF-β含量。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 Trizol法提取RNA,使用微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀(NanoDrop)檢測(cè)RNA濃度,保證OD260/OD280為1.8～2.0。按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃不限時(shí),cDNA產(chǎn)物保存于-20 ℃。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并委托上海生工生物公司合成。Foxp3上游引物序列:5′-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3′,下游引物序列5′-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3′;以GAPDH作為內(nèi)參照,上游引物序列:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列:5′-TGTAGACCATGTAG TTGAGGTCA-3′。按照Takara公司qRT-PCR反應(yīng)試劑盒操作說明進(jìn)行qRT-PCR操作,cDNA 1 μl,Forward Primer 0.5 μl,Reverse Primer 0.5 μl,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μl,ddH2O 3 μl,總量10 μl,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,使用實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad CFX96)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共35個(gè)循環(huán)。使用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖表。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,樣本間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KO小鼠脾臟Treg細(xì)胞上成功敲除CD226分子

脾臟Treg細(xì)胞CD226表達(dá)水平結(jié)果顯示:WT小鼠脾臟Treg細(xì)胞高表達(dá)CD226分子,表達(dá)水平為29.45%±1.43%;KO小鼠脾臟Treg細(xì)胞極低表達(dá)CD226分子,表達(dá)水平為0.1%±0.06%(見圖1)。以上結(jié)果表明KO小鼠脾臟Treg細(xì)胞已成功敲除CD226分子。

圖1 WT小鼠和KO小鼠脾臟Treg細(xì)胞CD226分子表達(dá)水平Figure 1 The expression level of CD226 in Treg from the spleens of WT and KO mice

2.2 敲除CD226分子后,小鼠EAE病情減緩

兩組小鼠EAE評(píng)分結(jié)果顯示:WT EAE組發(fā)病時(shí)間為(8.25±0.27)d,疾病評(píng)分為2.21±0.32;KO EAE組發(fā)病時(shí)間為(10.81±0.26)d,疾病評(píng)分1.60±0.31,兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。此外,WT EAE組高峰期體質(zhì)量減輕14.34%±0.69%;KO EAE組減輕較少(10.43%±0.37%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。結(jié)果提示敲除CD226后小鼠EAE發(fā)病減緩。

與WT EAE組相比,**P<0.01,*P<0.05圖2 免疫后WT和KO小鼠EAE疾病評(píng)分和EAE高峰期體質(zhì)量變化Figure 2 Changes of disease scores of EAE after immunization and body weight loss at the peak of EAE in WT and KO mice

2.3 KO EAE小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例增加

兩組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例檢測(cè)結(jié)果顯示:WT EAE組Treg細(xì)胞比例為11.02%±0.53%,KO EAE組為17.39%±0.78%,明顯高于WT EAE組(P<0.01,見圖3)。分選兩組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白3轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged-helix transcription factor box P3, Foxp3)mRNA相對(duì)表達(dá)量(見圖3),結(jié)果表明KO EAE組相對(duì)表達(dá)量高于WT組(P<0.01)。以上結(jié)果表明敲除CD226后EAE小鼠Treg數(shù)量和比例增高。

與WT EAE組相比較,*P<0.05,***P<0.001圖3 WT和KO小鼠EAE發(fā)病高峰期脾臟Treg細(xì)胞比例變化Figure 3 The percentages of Treg in spleen CD4+T cells from WT and KO mice at the peak of EAE

2.4 KO EAE小鼠Treg細(xì)胞分泌IL-10和TGF-β增高

檢測(cè)兩組小鼠Treg細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β水平,結(jié)果顯示:WT EAE組和KO EAE組IL-10水平分別為(17.41±1.5)ng/ml和(31.8±2.9)ng/ml,KO EAE組明顯高于WT EAE組(P<0.01,見圖4)。WT EAE組TGF-β水平為(35.1±2.8)pg/ml,KO EAE組為(52.7±5.2)pg/ml,KO EAE組明顯高于WT EAE組(P<0.05,見圖4)。以上結(jié)果表明,敲除CD226后EAE小鼠Treg細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子增高。

與WT EAE組相比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 WT EAE和KO EAE小鼠Treg細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of IL-10 and TGF-β in the culture supernatant of Treg from WT EAE and KO EAE mice

2.5 KO EAE小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)TIGIT和CTLA-4增高

檢測(cè)兩組小鼠發(fā)病高峰期脾臟Treg細(xì)胞TIGIT和CTLA-4表達(dá)情況,結(jié)果表明:KO小鼠EAE高峰期脾臟Treg細(xì)胞TIGIT表達(dá)高于WT EAE小鼠(26.43%±1.64%vs18.7%±2.17%,P<0.05,見圖5);KO小鼠EAE高峰期脾臟Treg細(xì)胞CTLA-4表達(dá)高于WT EAE小鼠(65.92%±5.53%vs45.74%±4.84,P<0.05,見圖5)。以上結(jié)果表明,敲除CD226后小鼠脾臟Treg細(xì)胞表達(dá)CTLA-4和TIGIT增高,推測(cè)CTLA-4和TIGIT在KO EAE小鼠上的高表達(dá)與Treg細(xì)胞增強(qiáng)的免疫抑制能力相關(guān)。

與WT EAE組相比較,*P<0.05圖5 WT EAE和KO EAE小鼠Treg細(xì)胞TIGIT和CTLA-4表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of TIGIT or CTLA-4 in Treg of WT and KO mice during EAE

3 討論

MS是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥和脫髓鞘為病變特點(diǎn)的自身免疫性疾病,EAE小鼠是進(jìn)行人類MS研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[12],MS和EAE發(fā)病與過強(qiáng)自身免疫應(yīng)答引起機(jī)體免疫耐受穩(wěn)態(tài)打破密切相關(guān)[13]。Treg細(xì)胞是維持自身免疫耐受和建立免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控的主要CD4+T細(xì)胞亞群,其數(shù)量異常和功能低下與MS和EAE的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[14]。

CD226為T細(xì)胞激活過程中重要的共刺激分子,研究表明CD4+T細(xì)胞及其亞群Treg高表達(dá)CD226分子,且在激活狀態(tài)下表達(dá)升高,CD226分子可參與CD4+初始T細(xì)胞的發(fā)育和分化過程[15]、Th細(xì)胞的極化過程[16]和Treg細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。Nabekura等[17]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗體阻斷CD226后可促進(jìn)Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受從而緩解移植物抗宿主反應(yīng),缺乏CD226的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)上升。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),小鼠注射CD226多克隆抗體后對(duì)EAE易感性降低,血清中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-10表達(dá)升高[7],基于此,我們推測(cè)CD226可能通過影響CD4+T細(xì)胞亞群中Treg細(xì)胞參與小鼠EAE的發(fā)生。為對(duì)上述問題深入研究,我們構(gòu)建了CD226 KO小鼠,應(yīng)用MOG35-55多肽進(jìn)行了小鼠EAE造模,結(jié)果顯示KO小鼠EAE發(fā)病延遲、疾病評(píng)分低且體質(zhì)量減輕較少,Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量增高,分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β升高,以上結(jié)果說明敲除CD226分子后EAE小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量增多,抑制性細(xì)胞因子分泌增多。

免疫分子CTLA-4和TIGIT在維持Treg抑制功能中發(fā)揮著重要作用[18,19],研究表明CTLA-4的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子Foxp3調(diào)控[20,21],MS和RA患者體內(nèi)CTLA-4基因表達(dá)異常[22];TIGIT可與CD226競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合共同配體CD155和CD112,CD226-TIGIT+Treg細(xì)胞抑制功能增強(qiáng)[23,24]。為明確敲除CD226后EAE小鼠Treg細(xì)胞CTLA-4和TIGIT的表達(dá)有無改變,以及這種改變是否直接影響到Treg的功能,我們檢測(cè)了兩組EAE小鼠Treg細(xì)胞CTLA-4和TIGIT的表達(dá)情況。結(jié)果表明KO EAE小鼠Treg表達(dá)TIGIT和CTLA-4均有所升高。文獻(xiàn)報(bào)道CD226缺乏促進(jìn)Treg高表達(dá)TIGIT從而促進(jìn)Treg擴(kuò)增并增強(qiáng)免疫抑制功能,最終導(dǎo)致移植物抗宿主反應(yīng)減弱[25],在缺乏CD226的情況下,TIGIT與配體CD155和CD112的交互作用增強(qiáng),從而提高Treg細(xì)胞的增殖能力和抑制功能[17,25],CTLA-4+Treg細(xì)胞免疫抑制能力增強(qiáng)[26],因此,我們分析敲除CD226后Treg細(xì)胞高表達(dá)TIGIT和CTLA-4與Treg功能增強(qiáng)密切相關(guān)。

綜合上述,本實(shí)驗(yàn)明確了敲除CD226后小鼠Treg細(xì)胞比例增高且抑制功能增強(qiáng),致使EAE病情減緩,此結(jié)果可為后期開發(fā)靶向CD226分子治療自身免疫性疾病提供一定的研究思路。