Fas/FasL途徑在PM2.5誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制

高彥軍,林紅衛(wèi),王在強(qiáng),金發(fā)光

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jinfag@fmmu.edu.cn)

隨著工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展,空氣污染對(duì)氣候、環(huán)境和健康構(gòu)成了重大威脅,導(dǎo)致全球每年約700萬(wàn)人過(guò)早死亡[1]。大氣顆粒物(particulate matter, PM)尤其是空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm的PM2.5,由于其體積較小,表面積較大,可以攜帶細(xì)菌和有毒化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)支氣管和肺泡并不易排出,更易引起呼吸系統(tǒng)疾病和肺功能損傷[2]。多項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查及臨床研究表明,PM2.5對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘、肺炎甚至肺癌的罹患或加重有著明確的相關(guān)性[3-6]。PM2.5導(dǎo)致肺損傷的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),活性氧(ROS)的產(chǎn)生和炎性細(xì)胞因子的分泌都可以通過(guò)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡引起肺損傷[7,8]。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有外源性途徑(死亡受體途徑)和內(nèi)源性途徑(線粒體途徑)[9],有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。Fas/FasL是死亡受體途徑中的一組重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,當(dāng)FasL與Fas結(jié)合后,細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物(DISC),隨后催化Caspase-8前體激活,繼而激活下游Caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。因此,Fas/FasL可能在PM2.5誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引起肺損傷中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)建立PM2.5誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型,探討Fas/FasL途徑在肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

家兔抗Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,FasL中和性抗體(NOK-2)、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司,Caspase-8特異性抑制劑(Z-IETD-FMK)購(gòu)自美國(guó)R&D公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自Affinity公司,F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自武漢普諾賽公司,兔抗GAPDH多克隆抗體、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA裂解液及其他試劑均購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 PM2.5樣本采集與制備

本研究中PM2.5的采集方法參考本實(shí)驗(yàn)室先前的研究[12],于2019年6月至2020年12月在空軍軍醫(yī)大學(xué)科技樓樓頂,采用全自動(dòng)大氣顆粒物采樣器(MH1200,明華電子)收集PM2.5,將載有PM2.5的濾膜裁剪為小塊,浸入去離子水中,超聲振蕩15 min,重復(fù)3次,洗脫的顆粒物用6層無(wú)菌紗布過(guò)濾,真空冷凍干燥,低溫保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)前稱取處理好的PM2.5,用PBS溶解配制不同濃度的PM2.5懸液,超聲振蕩混勻,密閉容器中高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min),置4 ℃冰箱備用,使用前再次超聲振蕩混勻。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

6～8周齡雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(200±20)g,由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK 2017-0021)提供,隨機(jī)分為4組(n=6):對(duì)照組(PBS)、PM2.5低劑量組(2.5 mg/kg)、中劑量組(5 mg/kg)和高劑量組(10 mg/kg),用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠,建模方法采用氣管滴注,于第1,3,5天滴入0.5 ml PM2.5混懸液(PM2.5低、中、高劑量組的滴注濃度分別為1,2,4 mg/ml),對(duì)照組滴注等量PBS,PM2.5混懸液的劑量選擇基于本課題組之前的研究[13]并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。最后一次氣管滴注操作完成后24 h處死大鼠,立即開胸取肺組織標(biāo)本。

1.4 CCL149細(xì)胞培養(yǎng)及處理

大鼠肺泡上皮細(xì)胞CCL149(美國(guó)ATCC)用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的F-12K培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)、傳代。細(xì)胞接種于6孔板中,在細(xì)胞增殖達(dá)到80%～90%時(shí)給予PM2.5暴露處理。為了探索PM2.5暴露處理的最適濃度和作用時(shí)間,我們首先開展一期、二期實(shí)驗(yàn)觀察PM2.5不同濃度及不同暴露時(shí)間對(duì)CCL149細(xì)胞凋亡率的影響。一期實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、25 μg/ml PM2.5組、50 μg/ml PM2.5組、100 μg/ml PM2.5組,PM2.5組每孔分別加入1 ml培養(yǎng)基和1 ml PM2.5混懸液(濃度分別為50,100,200 μg/ml),使其終濃度為25,50,100 μg/ml,對(duì)照組加入1 ml培養(yǎng)基和1 ml PBS,作用12 h;二期實(shí)驗(yàn)每孔加入1 ml培養(yǎng)基和1 ml 100 μg/ml PM2.5混懸液,使其終濃度為50 μg/ml,分別作用0,6,12,24 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)一、二期實(shí)驗(yàn)CCL149細(xì)胞凋亡情況,具體方法見(jiàn)后述。

根據(jù)一、二期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考慮到體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的差異以及PM2.5濃度過(guò)大、作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易發(fā)生細(xì)胞壞死,比較后選擇50 μg/ml PM2.5暴露處理12 h作后續(xù)細(xì)胞深入研究。將CCL149細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、PM2.5組、PM2.5+NOK-2(FasL中和性抗體)組和PM2.5+Z-IETD-FMK(Caspase-8特異性抑制劑)組,PM2.5暴露處理組加入1 ml培養(yǎng)基和1 ml 100 μg/ml PM2.5混懸液(終濃度為50 μg/ml),對(duì)照組加入1 ml培養(yǎng)基和1 ml PBS,作用12 h。PM2.5+NOK-2組和PM2.5+Z-IETD-FMK組在加入PM2.5混懸液前1 h分別加入10 μg/ml NOK-2或20 μM Z-IETD-FMK進(jìn)行干預(yù)。以上各組均設(shè)3組復(fù)孔。

1.5 肺組織病理學(xué)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取大鼠右上肺組織于4%多聚甲醛中固定,脫水、石蠟包埋、切片,標(biāo)本行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)分析。肺組織細(xì)胞凋亡用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口標(biāo)記(TUNEL)法進(jìn)行檢測(cè),染色方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,在熒光顯微鏡下觀察、分析。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCL149細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)干預(yù)完畢,6孔板中加入0.5 ml胰酶消化液消化2～3 min,然后加入1.5 ml培養(yǎng)基終止消化,將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),1 000 r/min離心5 min,棄上清,PBS充分洗滌后用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法染色,立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blot, WB)法檢測(cè)肺組織和CCL149細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

根據(jù)肺組織HE和TUNEL染色結(jié)果,選擇中劑量組作為實(shí)驗(yàn)組,采用Western blot檢測(cè)Fas/FasL途徑上游分子Fas及凋亡最終執(zhí)行者Caspase-3在肺組織中的表達(dá)。具體方法為:取大鼠右下肺約40 mg剪碎,加入適量RIPA裂解液(含1%PMSF和磷酸酶抑制劑)置于冰上裂解,提取大鼠肺組織蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,12% SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉,加入相應(yīng)一抗,Fas、Caspase-3、GAPDH稀釋比分別為1 ∶1 000,1 ∶500,1 ∶2 500,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,加入二抗常溫避光孵育1 h,TBST洗膜3次,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能)進(jìn)行顯影拍攝,條帶用GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

為進(jìn)一步闡明Fas/FasL途徑在細(xì)胞凋亡中的作用,檢測(cè)CCL149細(xì)胞中Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。具體方法為:處理完畢的CCL149細(xì)胞倒掉培養(yǎng)基,加入適量RIPA裂解液冰上裂解,提取蛋白,后續(xù)Western blot操作方法同上述。其中Fas、Caspase-3、GAPDH一抗稀釋比同上述,FasL稀釋比為1 ∶500、Caspase-8稀釋比為1 ∶5 000。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)改變和細(xì)胞凋亡

經(jīng)HE染色,鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠肺組織正常,肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)無(wú)滲出,僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞;氣管滴入PM2.5混懸液后,大鼠雙肺表面多可見(jiàn)散在出血點(diǎn)和血斑,切面可見(jiàn)暗紅色斑片,鏡下可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁增厚、斷裂,且有水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),尤以中劑量組和高劑量組變化明顯(見(jiàn)圖1A)。TUNEL染色結(jié)果顯示,隨著PM2.5濃度升高,肺組織細(xì)胞凋亡率逐漸升高,與對(duì)照組相比,中劑量組及高劑量組凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),低、中、高劑量組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖1B)。

2.2 PM2.5暴露后大鼠肺組織Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)變化

與對(duì)照組比較,PM2.5中劑量組(5 mg/kg)大鼠肺組織中Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖2)。

2.3 PM2.5暴露處理及NOK-2、Z-IETD-FMK干預(yù)對(duì)CCL149細(xì)胞凋亡的影響

PM2.5暴露后,CCL149細(xì)胞凋亡率明顯增高,且呈濃度和時(shí)間依賴性(P<0.05,見(jiàn)圖3)。與對(duì)照組比較,PM2.5組凋亡率明顯增高(P<0.01,見(jiàn)圖4)。經(jīng)NOK-2、Z-IETD-FMK干預(yù)后,與PM2.5組相比,PM2.5+NOK-2組和PM2.5+Z-IETD-FMK組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01),但仍較對(duì)照組高(P<0.05,見(jiàn)圖4)。

圖1 PM2.5可致大鼠肺組織損傷和細(xì)胞凋亡Figure 1 PM2.5 induces lung injury and cell apoptosis in rats

與對(duì)照組比較,**P<0.01圖2 PM2.5暴露處理后大鼠肺組織Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)變化Figure 2 Protein expression of Fas, Caspase-3 in rat lung tissue after PM2.5 treatment

2.4 CCL149細(xì)胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)變化

PM2.5組、PM2.5+NOK-2組和PM2.5+Z-IETD-FMK組CCL149細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)均較對(duì)照組升高(P<0.01);與PM2.5組比較,PM2.5+NOK-2組和PM2.5+Z-IETD-FMK組Fas蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05，見(jiàn)圖5)。

PM2.5組和PM2.5+Z-IETD-FMK組FasL蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);PM2.5+NOK-2組FasL蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與PM2.5組比較,PM2.5+NOK-2組FasL蛋白表達(dá)降低(P<0.05),而PM2.5+Z-IETD-FMK組FasL蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。

PM2.5組Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與PM2.5組比較,PM2.5+NOK-2組和PM2.5+Z-IETD-FMK組Caspase-8和Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.01),但仍較對(duì)照組高(P<0.05)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PM2.5組比較,##P<0.01圖4 NOK-2和Z-IETD-FMK干預(yù)對(duì)PM2.5暴露后CCL149細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of NOK-2 or Z-IETD-FMK on apoptosis after PM2.5 treatment

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與PM2.5組比較,#P<0.05,##P<0.01圖5 NOK-2和Z-IETD-FMK干預(yù)對(duì)PM2.5暴露后CCL149細(xì)胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)影響Figure 5 Effect of NOK-2 or Z-IETD-FMK on protein expression of Fas, FasL, Caspase-8 and Caspase-3 in CCL149 cells after PM2.5 treatment

3 討論

空氣污染是影響全球呼吸健康的主要環(huán)境問(wèn)題[14]。有證據(jù)表明,空氣中PM2.5濃度的增加與肺部疾病或心血管疾病發(fā)病率的升高有關(guān)[15]。呼吸道是PM2.5進(jìn)入體內(nèi)的關(guān)鍵通道,肺是主要受影響的器官[16]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)氣管滴注PM2.5后,大鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的組織病理學(xué)改變,表現(xiàn)為肺組織結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁增厚、斷裂,且有水腫、出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等,并且隨著PM2.5濃度的增加,這些損傷特征更為明顯。

本實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明PM2.5可導(dǎo)致肺組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[13],過(guò)量產(chǎn)生的活性氧(ROS)和炎性細(xì)胞因子是PM2.5誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡的關(guān)鍵因素[17]。有研究表明,肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡是導(dǎo)致肺損傷的重要因素[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PM2.5可導(dǎo)致大鼠肺組織細(xì)胞和CCL149細(xì)胞凋亡,且隨著濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),凋亡率明顯升高。這與HE染色結(jié)果一致,提示肺泡上皮細(xì)胞凋亡可能是PM2.5致肺損傷的重要機(jī)制之一。考慮到體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的差異以及PM2.5濃度過(guò)大、作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易發(fā)生細(xì)胞壞死,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選擇50 μg/ml PM2.5暴露處理12 h進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞深入研究。

細(xì)胞凋亡的主要途徑包括死亡受途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,Fas/FasL系統(tǒng)是死亡受體途徑中的一組重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在許多細(xì)胞的凋亡中起主要作用,是某些疾病發(fā)生的基本機(jī)制[19]。Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡始于FasL與受體Fas的結(jié)合,使Fas形成能傳遞信號(hào)的活性形式——三聚體,Fas的胞內(nèi)區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域(DD)可與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(FADD)偶聯(lián),然后再通過(guò)FADD的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)與Caspase-8前體偶聯(lián),形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC),活化Caspase-8,并釋放到細(xì)胞質(zhì)中,從而將胞外的凋亡信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi),迅速激活Caspase-3,最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡執(zhí)行[20,21]。為了解Fas/FasL途徑在PM2.5致肺損傷和細(xì)胞凋亡中的作用,本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法分析了Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,PM2.5暴露后,大鼠肺組織和CCL149細(xì)胞Fas、FasL、Caspase-8和Caspase-3蛋白上調(diào),上述蛋白表達(dá)的升高與肺組織病理學(xué)改變、TUNEL染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果是一致的,說(shuō)明PM2.5可以通過(guò)Fas/FasL途徑誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡,這與本課題組先前的研究結(jié)果相符[12,13]。

已報(bào)道抑制Fas/FasL途徑可減輕LPS和海水導(dǎo)致的急性肺損傷[19,22]。為明確PM2.5誘導(dǎo)的CCL149細(xì)胞凋亡與Fas/FasL上調(diào)之間是否有直接關(guān)系,本研究使用抗FasL中和性抗體NOK-2和Caspase-8特異性抑制劑Z-IETD-FMK進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,NOK-2可阻斷Fas/FasL相互作用,保護(hù)CCL149細(xì)胞免受PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Z-IETD-FMK也能有效地阻斷PM2.5誘導(dǎo)的CCL149細(xì)胞凋亡,表明Fas死亡受體通路是由Caspase-8介導(dǎo)的。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)NOK-2不能影響Fas的表達(dá)但可以抑制Caspase-8和Caspase-3的剪切活化,Z-IETD-FMK抑制了PM2.5引起的Caspase-8和Caspase-3的剪切,但對(duì)Fas和FasL表達(dá)沒(méi)有作用。這一現(xiàn)象說(shuō)明,在凋亡通路中Fas和FasL結(jié)合出現(xiàn)在Caspase-8和Caspase-3活化的上游位置。

綜上所述,PM2.5暴露可以誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞的凋亡,Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的肺組織細(xì)胞凋亡在PM2.5誘導(dǎo)的肺損傷中具有重要作用。這為從凋亡角度入手對(duì)PM2.5導(dǎo)致的肺損傷進(jìn)行預(yù)防和臨床救治提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。需要指出的是,無(wú)論是NOK-2還是Z-IETD-FMK都不能完全阻斷PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,提示PM2.5致肺損傷的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的,還有其他信號(hào)機(jī)制參與。因此,針對(duì)PM2.5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。