心肌缺血再灌注損傷對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知功能和雌激素水平的影響

陳 焱,韓沖芳,楊文曲,趙雪麗,常 鑫

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,同濟(jì)山西醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:hanchongfang2003@foxmail.com)

雌激素可以舒張冠脈、降低血壓和調(diào)節(jié)膽固醇代謝,從而改善冠脈微循環(huán)并降低冠脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。由于雌激素水平降低,圍絕經(jīng)期女性冠心病發(fā)病率顯著增加[4]。及時(shí)恢復(fù)心肌血流灌注是治療冠心病心肌缺血的必要措施。然而在成年雄性大鼠中,心肌再灌注過程不僅會(huì)導(dǎo)致心肌損傷,也會(huì)損傷腦組織[5]。研究認(rèn)為,雌激素可通過減輕心肌再灌注損傷引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),減少梗死面積并改善心功能[6]。雌激素也可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的激活、維持神經(jīng)元活性和功能,對(duì)創(chuàng)傷性和缺血性腦損傷起到保護(hù)作用[7,8]。心肌缺血再灌注損傷對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知功能和雌激素水平的影響尚不清楚,本研究擬探討心肌缺血再灌注損傷對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知功能和雌激素水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

雌性健康SD大鼠60只,15～20月齡,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠均在(23±3)℃潔凈干燥、水與食物充足的環(huán)境中適應(yīng)7 d,晝夜各12 h。造模前禁食12 h,不禁水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與心肌缺血再灌注模型的制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=20):對(duì)照組(Con組)、假手術(shù)組(sham組)、心肌缺血再灌注組(MIR組)。MIR組大鼠在自制麻醉箱中以3%七氟醚(批號(hào):0Z072,Maruiahi Pharmaceutical Co,中國深圳)進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)5 min,以2%七氟醚維持麻醉2.5 h。行經(jīng)口氣管插管,連接ALC-V8動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)行機(jī)械通氣(頻率60次/min、潮氣量20 ml/kg、吸/呼比1 ∶2),行股動(dòng)脈穿刺置管術(shù)并通過BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)行心電、血壓監(jiān)護(hù)。經(jīng)胸骨左緣3～4肋間開胸,打開心包,在左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐之間用6-0絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。30 min后松開絲線,恢復(fù)灌注120 min后縫合組織關(guān)閉胸腔,采用荷包縫合法縫皮。sham組僅穿線不結(jié)扎;Con組不加處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Morris水迷宮試驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)、運(yùn)動(dòng)能力與認(rèn)知功能 三組大鼠造模前連續(xù)6 d行定向航行試驗(yàn),每日3次。平臺(tái)固定于SE象限。引導(dǎo)大鼠在平臺(tái)上學(xué)習(xí)30 s后,隨機(jī)將其放入任意象限。通過攝像系統(tǒng)化軟件自動(dòng)跟蹤記錄其各時(shí)日游泳速度和潛伏期。如60 s內(nèi)大鼠未找到平臺(tái),則潛伏期記為60 s,并再次引導(dǎo)大鼠在平臺(tái)學(xué)習(xí)15 s。定向航行試驗(yàn)中游泳速度反應(yīng)大鼠造模前運(yùn)動(dòng)能力,潛伏期反應(yīng)大鼠造模前學(xué)習(xí)、記憶認(rèn)知功能。

造模1 d后行空間探索試驗(yàn)。撤去平臺(tái),將軟件設(shè)置為識(shí)別原平臺(tái)所在位置。將大鼠隨機(jī)放入任意象限,跟蹤記錄大鼠游泳速度和穿越原平臺(tái)的次數(shù)?？臻g探索試驗(yàn)中游泳速度反應(yīng)大鼠造模后運(yùn)動(dòng)能力,穿越平臺(tái)次數(shù)反應(yīng)大鼠造模后記憶認(rèn)知功能。

1.3.2 ELISA法檢測大鼠血清cTnI濃度 MIR組大鼠于結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前和造模后分別抽取股動(dòng)脈血5 ml,室溫靜置2 min,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min。取上清液,分裝,于-80 ℃冰箱保存。按照cTnI ELISA定量檢測試劑盒說明書(泉州市睿信生物科技有限公司,RX302234R)測定450 nm波長下的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線,計(jì)算大鼠心肌缺血前和造模后血清cTnI濃度。

1.3.3 ELISA法檢測大鼠血清雌激素濃度 Con組和sham組大鼠于造模后抽取股動(dòng)脈血3 ml,室溫靜置后,4 ℃ 3 500 r/min離心5 min,取上清液,同時(shí)取MIR組大鼠造模后上清液樣本,按照E2 ELISA定量檢測試劑盒說明書(泉州市睿信生物科技有限公司,RXJ302812R),繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線,計(jì)算各組大鼠造模后血清雌激素水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MIR組血清cTnI濃度配對(duì)分析

造模后血清cTnI濃度較結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前血清cTnI濃度顯著升高[(1.95±0.33)μg/Lvs(0.59±0.16)μg/L,t=17.06,P<0.05]。

2.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 定向航行試驗(yàn)結(jié)果 3組間大鼠各日游泳速度和潛伏期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖1,2),各組大鼠潛伏期均逐日縮短。

圖1 各組大鼠在定向航行試驗(yàn)中的游泳速度Figure 1 Swimming speed of rats in the place navigation test in each group

2.2.2 空間探索試驗(yàn)結(jié)果 Con組、sham組和MIR組大鼠游泳速度分別為(15.60±1.32)cm/s、(16.02±1.30)cm/s和(15.78±1.32)cm/s,三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3)。Con組、sham組和MIR組穿越平臺(tái)次數(shù)分別為(18.65±4.16)次、(13.00±3.45)次和(6.85±3.73)次;與Con組相比,sham組和MIR組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05);與sham組相比,MIR組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05,見圖4)。

圖2 各組大鼠在定向航行試驗(yàn)中的潛伏期Figure 2 Latency of rats in the place navigation test in each group

圖3 各組大鼠在空間探索試驗(yàn)中的游泳速度Figure 3 Swimming speed of rats in the space navigation test in each group

與Con組相比，*P<0.05;與sham組相比，#P<0.05圖4 各組大鼠在空間探索試驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)Figure 4 Times of crossing the platform of rats in the place navigation test in each group

2.3 造模后各組大鼠雌激素水平

Con組、sham組和MIR組大鼠造模后雌激素水平分別為(87.70±18.62)pg/ml、(90.00±16.07)pg/ml和(94.82±20.35)pg/ml,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

圖5 各組大鼠造模后雌激素水平Figure 5 Levels of estrogen after the modeling in each group

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)[9]采用經(jīng)典的方法結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min再灌注120 min制備圍絕經(jīng)期大鼠心肌缺血再灌注模型,并通過心肌損傷的高特異性和高敏感性標(biāo)志物血清cTnI檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽淝闆r,結(jié)果表明再灌注后血清cTnI濃度較結(jié)扎前顯著上調(diào),提示圍絕經(jīng)期大鼠心肌缺血再灌注模型制備成功。

自圍絕經(jīng)期開始,雌激素水平不斷下降使其介導(dǎo)的心血管保護(hù)作用也逐漸減弱,女性冠心病發(fā)病率隨之顯著上升,且自然絕經(jīng)早期更易罹患冠心病[10,11]。盡快恢復(fù)冠脈血流灌注是冠心病治療措施的核心目標(biāo)。而心肌再灌注過程不僅會(huì)加重心肌組織損傷、損害心功能,還會(huì)導(dǎo)致語言、記憶、認(rèn)知速度與執(zhí)行功能等認(rèn)知功能下降[12,13]。研究表明,心肌缺血再灌注損傷可以引發(fā)成年雄性大鼠空間記憶障礙和長時(shí)程增強(qiáng)受損等海馬依賴性認(rèn)知障礙[13,14]。心肌缺血再灌注損傷是否會(huì)對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知功能造成相似的損傷,尚未得到證實(shí)。本研究通過Morris水迷宮定向航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)分別評(píng)價(jià)心肌缺血再灌注損傷前后圍絕經(jīng)期大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)能力和記憶水平,判斷心肌缺血再灌注損傷對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知功能的影響。定向航行試驗(yàn)結(jié)果顯示,各組大鼠每日游泳速度和潛伏期均無顯著差異,表明各組大鼠學(xué)習(xí)和運(yùn)動(dòng)能力相仿;潛伏期呈現(xiàn)逐日縮短的趨勢(shì),提示各組大鼠均對(duì)平臺(tái)位置產(chǎn)生了相對(duì)明確的記憶,排除了各組大鼠造模前學(xué)習(xí)與運(yùn)動(dòng)能力差異對(duì)造模后水迷宮試驗(yàn)結(jié)果的影響。空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示,各組大鼠造模后運(yùn)動(dòng)能力仍相仿而MIR組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少,表明心肌缺血再灌注損傷引起了圍絕經(jīng)期大鼠海馬依賴性認(rèn)知功能下降。

雌二醇是活性最強(qiáng)的雌激素,可以維持缺血再灌注后心肌細(xì)胞線粒體膜電位,減少ROS生成,促進(jìn)心功能恢復(fù),也可以與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中相應(yīng)受體結(jié)合,提高與記憶和執(zhí)行功能有關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元突觸發(fā)生和可塑性調(diào)節(jié),從而促進(jìn)記憶形成[6,15]。研究表明,雌激素缺乏會(huì)降低雌鼠海馬突觸蛋白水平,引發(fā)空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷[16]。為探究心肌缺血再灌注損傷是否通過改變雌激素水平引發(fā)圍絕經(jīng)期大鼠認(rèn)知障礙,本研究通過ELISA定量檢測,發(fā)現(xiàn)各組大鼠造模后血清雌激素水平無顯著差異,表明心肌缺血再灌注后圍絕經(jīng)期大鼠雌激素水平無顯著改變,因而排除了心肌缺血再灌注后內(nèi)源性雌激素水平對(duì)認(rèn)知功能的影響。研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充雌二醇可以減輕繼發(fā)性腦損傷,改善認(rèn)知功能[17,18]。由此推測,雖然心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)認(rèn)知水平下降的過程不影響雌激素水平,但外源性雌二醇補(bǔ)充也可能有利于圍絕經(jīng)期大鼠心肌缺血再灌注后認(rèn)知功能的改善,后續(xù)可對(duì)此進(jìn)一步研究,為臨床治療提供思路。

不足之處:本研究未設(shè)置外源性雌二醇補(bǔ)充組或去勢(shì)大鼠組作對(duì)照,未能判斷雌激素水平的變化是否影響心肌缺血再灌注后認(rèn)知水平。

綜上所述,心肌缺血再灌注損傷會(huì)引發(fā)圍絕經(jīng)期大鼠海馬依賴性認(rèn)知功能下降,但不影響圍絕經(jīng)期大鼠血清雌激素水平。