色素上皮衍生因子對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖和分化的影響

吳 娟,姜 玨,王志芳,劉瑾華,吳金萍,李妙妮,楊麗娜*

(1兵器工業(yè)五二一醫(yī)院婦科,西安 710065;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科;*通訊作者,E-mail:ylina258@126.com)

子宮肌瘤是成年女性最常見的良性腫瘤,可通過多種方式擾亂子宮功能,可能導(dǎo)致子宮大出血、貧血、不孕、胚胎植入缺陷、早產(chǎn)、產(chǎn)程梗阻、尿失禁等[1]。子宮肌瘤的致病原因與雌激素異常分泌有關(guān),雌激素主要通過兩種不同的雌激素受體ERα和ERβ來(lái)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[2]。許多研究證實(shí),子宮肌瘤中ERα和ERβ的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常組織,并且可導(dǎo)致子宮肌瘤細(xì)胞過度增殖[2]。此外,雌激素可上調(diào)多種血管生成因子的表達(dá)[3],血管生成平衡受損是導(dǎo)致肌瘤形成的原因之一[4]。色素上皮衍生因子(PEDF,SERPINF1)是一種50 kD的酸性糖蛋白,它最初被描述為一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和有效的抗血管生成因子[5,6]。PEDF是內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF-R2血管生成信號(hào)的內(nèi)源性抑制劑,通過降低其關(guān)鍵的促有絲分裂受體VEGF-R2的VEGF-A活性,部分阻止新生血管的生長(zhǎng)[7]。后來(lái)的研究證實(shí)PEDF是一種多功能蛋白質(zhì),還具有抗炎和抗氧化特性[8,9]。最近,有文獻(xiàn)報(bào)道稱在子宮肌瘤細(xì)胞系培養(yǎng)液中加入重組PEDF可下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以及ERα和ERα的表達(dá),并抑制細(xì)胞增殖;重組PEDF可在體內(nèi)降低小鼠肌瘤的生長(zhǎng)速度[10]。雖然前人研究發(fā)現(xiàn)PEDF與子宮肌瘤的形成有關(guān),然而,確切的分子機(jī)制尚不清楚。因此,本研究擬探討PEDF對(duì)子宮肌瘤中子宮平滑肌細(xì)胞增殖和分化的影響,旨在進(jìn)一步揭示子宮肌瘤的發(fā)生機(jī)制,并為開發(fā)新的治療方案提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司。Lipofectamine 2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。EdU Apollo 567、DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑、裂解緩沖液碧云天生物技術(shù)研究所。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司。SYBR Green Real time PCR Master Mix購(gòu)自日本Takara公司。PEDF、ERα、ERβ、SM22α、α-SMA、Bcl-2、cleaved Caspase-3、PI3K、total-AKT、p-AKT、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 組織收集、細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

為了考察PEDF在子宮肌瘤組織和正常子宮肌層組織中的表達(dá)差異,收集我院接受子宮肌瘤切除術(shù)的30例患者的子宮肌瘤組織(子宮肌瘤組織組)以及鄰近正常子宮肌層組織(正常子宮肌層組織組),患者年齡在39～52歲之間。患者納入標(biāo)準(zhǔn):①組織學(xué)診斷為子宮肌瘤;②術(shù)前3個(gè)月無(wú)服雌孕激素史;③無(wú)子宮內(nèi)膜病變及肌瘤變性;④患者無(wú)免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病、器官病變及其他嚴(yán)重疾病;⑤患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并子宮頸及子宮內(nèi)膜惡性病變、肌瘤變性的患者;②近期有抗生素、激素等藥物使用史的患者;③合并其他嚴(yán)重疾病的患者。通過Western blot和qRT-PCR檢測(cè)子宮肌瘤組織以及鄰近正常子宮肌層組織中的PEDF蛋白和mRNA水平。

將組織切成小塊并在37 ℃下用0.15%膠原酶消化2～3 h。然后加入預(yù)冷的胎牛血清(FBS)5 ml,在4 ℃以1 500 r/min離心10 min,收集平滑肌瘤細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次。棄去上清液并收集沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞在添加有20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)48 h。然后使用平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物(α-SMA)通過免疫熒光鑒定選擇的細(xì)胞是否是平滑肌細(xì)胞。將鑒定的子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究通過兵器工業(yè)五二一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào):兵工521倫審[2019]12號(hào)]),參與本研究的患者均簽署知情同意書。

通過SM22α免疫熒光染色觀察子宮肌層平滑肌細(xì)胞和子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞形態(tài)。將玻片放入6孔板中,然后加入1×104個(gè)子宮肌層平滑肌細(xì)胞(子宮肌層平滑肌細(xì)胞組)或子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞(子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞組)培養(yǎng)48 h,取出爬片,PBS洗滌,4%多聚甲醛室溫固定30 min,0.1% Triton X-100滲透2 min。PBS洗滌,胎牛血清封閉30 min,然后滴加SM22α一抗并在4 ℃孵育過夜,然后與FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗在37 ℃孵育30 min,用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,并在倒置熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理

委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成靶向PEDF基因序列的短發(fā)夾RNA(shRNA-PEDF,PEDF抑制劑)和陰性對(duì)照shRNA(shRNA-NC)以及過表達(dá)PEDF的重組慢病毒(PEDF-pLenti6.3,PEDF激動(dòng)劑)和陰性對(duì)照慢病毒(pLenti6.3-NC)。細(xì)胞共分為以下5組:對(duì)照組、pLenti6.3-NC組、PEDF-pLenti6.3組、shRNA-NC組、shRNA-PEDF組。然后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,pLenti6.3-NC組轉(zhuǎn)染pLenti6.3-NC,PEDF-pLenti6.3組轉(zhuǎn)染PEDF-pLenti6.3,shRNA-NC組轉(zhuǎn)染shRNA-NC,shRNA-PEDF組轉(zhuǎn)染shRNA-PEDF。使用Lipofectamine 2000對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),為了考察PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡、分化和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞活力,EdU染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖,TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中PEDF mRNA的水平,Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PEDF、ERα、ERβ、SM22α、α-SMA、Bcl-2、cleaved Caspase-3、PI3K、total-AKT和p-AKT的蛋白水平。

1.4 計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞活力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,離心收集細(xì)胞,然后用PBS洗滌,制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞(6×103個(gè)/孔)接種到含有100 μl DMEM/F12培養(yǎng)液的96孔板中,每孔加入10 μl細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)溶液。孵育48 h后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖

采用EdU染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。首先,將6×103細(xì)胞接種于96孔板中,加入EdU Apollo 567溶液處理細(xì)胞30 min。然后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。最后在熒光顯微鏡下觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

使用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染后將1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,4%多聚甲醛室溫固定30 min,0.1% Triton X-100(溶于0.1%枸櫞酸鈉溶液)滲透2 min。PBS洗滌,TUNEL反應(yīng)混合物37 ℃孵育細(xì)胞1 h,DAPI染色后,用奧林巴斯熒光顯微鏡對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)分析組織和細(xì)胞中PEDF mRNA水平

用Trizol試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA,并根據(jù)說明書使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄2 μg的總RNA。使用分光光度計(jì)測(cè)量并計(jì)算RNA濃度。使用SYBR Green real time PCR Master Mix在Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。PEDF引物的上游和下游序列分別是5′-CCAGACGCGTACGATAGTAG-3′和5′-GAAGTATCCAATAGCTACCCG-3′。GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照,引物的上游和下游序列分別是5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′和5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性30 s,52～58 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt計(jì)算PEDF的相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Western blot檢測(cè)分析組織或細(xì)胞中PEDF、ERα、ERβ、SM22α、α-SMA、Bcl-2、cleaved Caspase-3、PI3K、total-AKT和p-AKT的蛋白水平

將組織和細(xì)胞在裂解緩沖液中裂解,然后蛋白質(zhì)在12% SDS-PAGE上電泳。隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。然后將膜與PEDF(1 ∶1 000)、ERα(1 ∶2 000)、ERβ(1 ∶2 000)、SM22α(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶2 000)、Bcl-2(1 ∶2 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶3 000)、PI3K(1 ∶2 000)、total-AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)一抗在4 ℃過夜孵育。用TBST洗滌后,將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶3 000)在室溫下孵育1 h。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進(jìn)行顯影。使用Image J對(duì)所得條帶的強(qiáng)度進(jìn)行量化。GAPDH用作內(nèi)部參考。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過SPSS軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗(yàn)。本研究中所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮肌瘤組織和平滑肌細(xì)胞中PEDF的表達(dá)

與正常子宮肌層組織相比,子宮肌瘤組織中PEDF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(t=13.221,P<0.001;t=10.297,P<0.001;見圖1)。與正常子宮肌層平滑肌細(xì)胞相比,子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中PEDF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低(t=12.464,P<0.001;t=13.563,P<0.001;見圖2)。

與正常子宮肌層平滑肌細(xì)胞比較,*P<0.05圖2 子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞和正常子宮肌層平滑肌細(xì)胞中PEDF的表達(dá)Figure 2 PEDF expression in uterine fibroids smooth muscle cells and normal myometrial smooth muscle cells

2.2 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖的影響

5組細(xì)胞中PEDF的mRNA(F=282.141,P<0.001)和蛋白(F=196.572,P<0.001)表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中PEDF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05,見圖3);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組的PEDF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05,見圖3)。

5組細(xì)胞相對(duì)活力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.336,P<0.001,見圖4)。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的相對(duì)活力顯著降低(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組細(xì)胞相對(duì)活力顯著升高(P<0.05)。各組EdU陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.105,P<0.001,見圖4)。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的EdU陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組EdU陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05,見圖4)。

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖3 子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中PEDF-pLenti6.3和shRNA-PEDF的轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency of PEDF-pLenti6.3 and shRNA-PEDF in uterine fibroids smooth muscle cells

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖4 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖的影響 (EdU染色×100)Figure 4 Effect of PEDF on the proliferation of uterine fibroids smooth muscle cells

2.3 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞凋亡的影響

5組TUNEL陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=158.809,P<0.001,見圖5)。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組TUNEL陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05)。5組細(xì)胞中Bcl-2(F=183.272,P<0.001)和cleaved Caspase-3(F=175.191,P<0.001)的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,cleaved Caspase-3顯著升高(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高,cleaved Caspase-3顯著降低(P<0.05,見圖6)。

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖5 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞凋亡的影響 (TUNEL染色,×100)Figure 5 Effect of PEDF on the apoptosis of uterine fibroids smooth muscle cells

2.4 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞分化的影響

SM22α主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。子宮肌層平滑肌細(xì)胞的肌絲清晰,排列整齊,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則。子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的肌絲排列不規(guī)則,呈網(wǎng)狀或團(tuán)狀(見圖7)。

5組細(xì)胞中SM22α(F=137.024,P<0.001)和α-SMA(F=165.753,P<0.001)的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞SM22α和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組SM22α和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖8)。

2.5 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中ERα和ERβ表達(dá)的影響

5組細(xì)胞中ERα(F=159.676,P<0.001)和ERβ(F=134.397,P<0.001)的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的ERα和ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組ERα和ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖9)。

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖6 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effect of PEDF on the protein expression of Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in uterine fibroids smooth muscle cells

綠色熒光:SM22α;藍(lán)色熒光:DAPI圖7 子宮肌層平滑肌細(xì)胞和子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞形態(tài) (×1 000)Figure 7 Morphology of normal myometrial smooth muscle cells and smooth muscle cells of uterine fibroids (×1 000)

2.6 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的影響

5組PI3K(F=142.972,P<0.001)和p-AKT(F=191.951,P<0.001)的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與pLenti6.3-NC組相比,PEDF-pLenti6.3組子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與shRNA-NC組相比,shRNA-PEDF組PI3K和p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖10)。然而,各組total-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.398,P=0.806,見圖10)。

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖8 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞SM22α和α-SMA蛋白表達(dá)的影響Figure 8 Effect of PEDF on the expression of SM22α and α-SMA proteins in uterine fibroids smooth muscle cells

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖9 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞ERα和ERβ蛋白表達(dá)的影響Figure 9 Effect of PEDF on the expression of ERα and ERβ proteins in uterine fibroids smooth muscle cells

與pLenti6.3-NC組比較,*P<0.05;與shRNA-NC組比較,#P<0.05圖10 PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞PI3K、total-AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的影響Figure 10 Effect of PEDF on the expression of PI3K, total-AKT and p-AKT proteins in uterine fibroids smooth muscle cells

3 討論

PEDF是由SERPINF1編碼的一種50 kD的蛋白,屬于serpin家族[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤組織和平滑肌細(xì)胞中PEDF的表達(dá)被抑制,提示PEDF的低表達(dá)可能參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。其他文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道PEDF具有多種生物學(xué)功能,主要的功能包括抗多種疾病的血管生成、抗炎、抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等[5,6,12-14]。為了進(jìn)一步揭示PEDF在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用,本研究通過對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEDF-pLenti6.3來(lái)上調(diào)PEDF的表達(dá),轉(zhuǎn)染shRNA-PEDF來(lái)下調(diào)PEDF的表達(dá),研究結(jié)果表明,上調(diào)PEDF明顯抑制了子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而,下調(diào)PEDF則起到了相反的作用。這些結(jié)果說明PEDF調(diào)節(jié)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。最近,Bar-Joseph等[10]使用重組PEDF處理子宮肌瘤細(xì)胞系,結(jié)果表明重組PEDF抑制了細(xì)胞增殖;另外,重組PEDF可在體內(nèi)降低小鼠背部異位子宮肌瘤的生長(zhǎng)速度。結(jié)合本研究結(jié)果可知,PEDF的確調(diào)控子宮肌瘤的生長(zhǎng)。另外,研究表明[15]PEDF的直接和間接抗腫瘤作用在很大程度上依賴于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,并通過多種調(diào)控機(jī)制影響細(xì)胞凋亡。PEDF可直接或間接調(diào)控FasL、Bcl-2家族蛋白、Caspases、c-Flip、NFAT和PEDF-R的表達(dá),從而影響細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果也說明上調(diào)PEDF通過影響B(tài)cl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)從而抑制了子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的凋亡。

子宮肌瘤的發(fā)生是由子宮平滑肌細(xì)胞的異常增殖和分化引起的[16]。α-SMA和SM22α是平滑肌細(xì)胞分化狀態(tài)的標(biāo)志物[17]。本研究結(jié)果表明上調(diào)PEDF明顯抑制了子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中α-SMA和SM22α的表達(dá),從而抑制了分化。其他文獻(xiàn)也報(bào)道,PEDF可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化[11]。因此,PEDF可能也通過調(diào)控平滑肌細(xì)胞分化從而影響子宮肌瘤的生長(zhǎng)。

子宮肌瘤發(fā)生在育齡階段,其他學(xué)者認(rèn)為子宮肌瘤可能是雌激素依賴性良性腫瘤[18,19]。先前的研究證實(shí)ERα在子宮肌瘤中的表達(dá)高于在正常子宮平滑肌中的表達(dá)[20]。目前,ERα在子宮肌瘤中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注,ER調(diào)節(jié)劑、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑已被用于臨床治療子宮肌瘤[21]。本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)PEDF抑制了子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中ERα和ERβ表達(dá)。據(jù)報(bào)道,當(dāng)突變型ERα從大鼠子宮肌瘤組織轉(zhuǎn)染到原代血管平滑肌細(xì)胞中時(shí),它將與野生型ERα競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雌激素反應(yīng)元件,并失活雌激素介導(dǎo)的信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡并抑制其生長(zhǎng)[20]。因此,這可能也是PEDF參與子宮肌瘤進(jìn)展的機(jī)制之一。本研究結(jié)果與Bar-Joseph等[10]研究一致,該研究發(fā)現(xiàn)重組PEDF處理子宮肌瘤細(xì)胞系可下調(diào)ERα和ERβ的表達(dá)。

PI3K/AKT信號(hào)通路是人類腫瘤中最頻繁激活的信號(hào)通路之一,也是研究最廣泛的一種信號(hào)通路[22]。PI3K可以激活A(yù)kt并調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、生長(zhǎng)、侵襲和其他過程[23]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活促進(jìn)了細(xì)胞增殖,并減少細(xì)胞凋亡,在癌細(xì)胞中可促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化和血管生成[24]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,PEDF以PEDFR依賴的方式通過PI3K/AKT信號(hào)通路增加GLUT4介導(dǎo)的大鼠缺血心肌葡萄糖攝取[25],提示PEDF對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路具有調(diào)控作用。因此,本研究探討了PEDF對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的影響。本研究證實(shí)下調(diào)PEDF促進(jìn)了子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。此外,上調(diào)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞中的PEDF則抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。由于PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[26,27],因此,本研究結(jié)果說明PEDF至少部分通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路影響子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的增殖和分化。

綜上所述,本研究表明PEDF在子宮肌瘤中被抑制。上調(diào)PEDF可抑制子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞的增殖和分化,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制部分是通過PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的。因此,PEDF可能是評(píng)價(jià)子宮肌瘤生長(zhǎng)的候選標(biāo)志物,而重組PEDF可能是治療子宮肌瘤的新型藥物。