流式CBA檢測TH1/TH2細(xì)胞因子譜在細(xì)菌感染中的應(yīng)用

陳葆國 沈芝穎 鄭 瑞 章衛(wèi)國 石衛(wèi)武

細(xì)菌感染是當(dāng)前臨床患者發(fā)病和死亡的主要原因之一，早期快速、敏感、特異地診斷細(xì)菌感染對臨床治療尤為重要。診斷細(xì)菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌培養(yǎng)，但因其培養(yǎng)周期長、陽性率低等原因，不利于細(xì)菌感染的早期診斷和臨床用藥。目前常規(guī)檢測感染的指標(biāo)如外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和紅細(xì)胞沉降率(ESR)等，包括近年應(yīng)用較多的降鈣素(PCT)均屬于非特異性指標(biāo)，對細(xì)菌感染的診斷特異性不高[1～3]。近年來，Tang等[4]報(bào)道，在兒童血液腫瘤患者中TH1/TH2細(xì)胞因子譜檢測對細(xì)菌性感染有較高的敏感度和特異性。本研究通過檢測病原學(xué)檢驗(yàn)明確的細(xì)菌感染患者、非細(xì)菌感染者和健康對照者外周血TH1/TH2細(xì)胞因子譜表達(dá)特征，與CRP的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，探討TH1/TH2細(xì)胞因子譜在診斷細(xì)菌感染患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

對象與方法

1.研究對象: 健康對照組為2017年8月～2018年8月參加浙江省臺(tái)州醫(yī)院健康體檢者67名，其中男性44名、女性23名，年齡22～61歲，中位年齡50歲，外周血WBC計(jì)數(shù)為(5.9～9.9)×109/L，Neu%為53.0%～68.7%，無肝功能、腎功能和心血管異常。患者組為2017年8月～2018年8月來浙江省臺(tái)州醫(yī)院就診的住院患者153例，其中男性82例，女性71例，患者年齡21～75歲，中位年齡55歲。根據(jù)臨床診斷及病原體分離明確為細(xì)菌感染患者111例，細(xì)菌感染組又根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果分為革蘭陽性(G+)菌組(55例)和革蘭陰性(G-)菌組(56例)。非細(xì)菌感染組42例，分別為病毒感染27例，真菌感染15例。

2.細(xì)胞因子檢測：檢測所需試劑和儀器主要是細(xì)胞微球芯片技術(shù)(CBA)TH1/TH2細(xì)胞因子試劑盒(BD CBA Human Th1/Th2 CytokineKit，美國BD公司)和FACSCanto流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。具體步驟為以5ml注射器抽取患者外周靜脈血3ml，37℃水浴1h后分離血清備用。試劑于室溫放置30min后將IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕獲微球混合，200×g離心5min棄上清，同體積加入血清樣本增強(qiáng)緩沖液，重懸微球避光反應(yīng)30min，每FACS管加入50μl混合捕獲微球，50μl待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)品，50μl PE標(biāo)記熒光抗體混勻。室溫避光反應(yīng)2.5h，每管加1ml洗液，200×g離心5min，每管加300μl洗液，于3h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測獲取的數(shù)據(jù)，用CBA軟件FCAP Array v3自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出樣本中各細(xì)胞因子含量。

3.超敏CRP檢測：5ml注射器抽取患者外周EDTA抗凝血2ml，按試劑說明進(jìn)行檢測。

4.診斷價(jià)值的測定: 根據(jù)健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組IL-6、IL-10、CRP的檢測結(jié)果繪制受試者工作特征(receiver operatingcharacteristic，ROC)曲線，得出IL-6、IL-10、CRP的最佳閾值、敏感度、特異性及約登指數(shù)。 并對G+細(xì)菌感染組和G-細(xì)菌感染組IL-6、IL-10、CRP的檢測結(jié)果繪制的ROC曲線下面積進(jìn)行比較，做出診斷性能評(píng)價(jià)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)為非正態(tài)性分布，用中位數(shù) [M(P2.5～P97.5)]表示，各組間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。ROC曲線應(yīng)用Medcalc 17.9.7軟件計(jì)算，組間ROC曲線下面積大小比較采用z檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.細(xì)菌感染組與健康對照組及非細(xì)菌感染組TH1/TH2細(xì)胞因子譜和CRP比較: IFN-γ在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=59.1,P<0.01)。與健康對照組比較，G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組IFN-γ表達(dá)水平均明顯增高(P均<0.01)。非細(xì)菌感染組IFN-γ表達(dá)水平高于G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組(P均<0.01)。TNF-α在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=69.4,P<0.01)。與健康對照組比較，G-細(xì)菌感染組、非細(xì)菌感染組TFN-α表達(dá)水平明顯增高(P均<0.01)。非細(xì)菌感染組和G-細(xì)菌感染組TNF-α表達(dá)水平高于G+細(xì)菌感染組(P均<0.01)。IL-2在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=32.7,P<0.01)。與健康對照組比較，G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組IL-2表達(dá)水平明顯增高(P均<0.01，表1、表2)。

IL-4在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=26.5,P<0.01)。G+細(xì)菌感染組、非細(xì)菌感染組IL-4表達(dá)水平高于健康對照組(P均<0.05)。IL-6在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=176.8,P<0.01)。G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組IL-6表達(dá)水平顯著高于對照組(P均<0.01)。IL-6在G-細(xì)菌感染組表達(dá)水平高于G+細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組(P均<0.01)。IL-6在G+細(xì)菌感染組表達(dá)水平高于非細(xì)菌感染組(P<0.01)。IL-10在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=145.1,P<0.01)。G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組的IL-10表達(dá)水平均高于對照組(P均<0.01)。G-細(xì)菌感染組的IL-10表達(dá)水平顯著高于G+細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組(P均<0.01)。CRP在健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=141.4,P<0.01)。G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組、非細(xì)菌感染組CRP表達(dá)水平顯著高于健康對照組(P均<0.01)，G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組CRP表達(dá)水平高于非細(xì)菌感染組(P均<0.01)，G-細(xì)菌感染組CRP表達(dá)水平低于G+細(xì)菌感染組(P<0.01)。

表1 細(xì)菌感染組與健康對照組及非細(xì)菌感染組TH1細(xì)胞因子譜比較 [M(P2.5～P97.5),pg/ml]

與對照組比較，*P<0.01；與非細(xì)菌感染組比較，#P<0.01;與G+細(xì)菌感染組比較，ΔP<0.01

表2 細(xì)菌感染組與健康對照組及非細(xì)菌感染組TH2細(xì)胞因子譜和CRP比較[M(P2.5～P97.5)]

與對照組比較，*P<0.01;與非細(xì)菌感染組比較，#P<0.01;與G+細(xì)菌感染組比較，ΔP<0.01

2.IL-6、IL-10、CRP診斷細(xì)菌感染的性能比較:根據(jù)健康對照組、G+細(xì)菌感染組、G-細(xì)菌感染組及非細(xì)菌感染組IL-6、IL-10、CRP的數(shù)據(jù)繪制ROC曲線(圖1、表3)。曲線下面積比較顯示，IL-6/G+細(xì)菌感染組ROC曲線面積明顯大于CRP/G+細(xì)菌感染組(z=4.49，P<0.01)。IL-6/G-細(xì)菌感染組ROC曲線面積明顯大于CRP/G-細(xì)菌感染組(z=4.64，P<0.01)。IL-10/G-細(xì)菌感染組ROC曲線面積明顯大于 CRP/G-細(xì)菌感染組(z=4.38，P<0.01)。其余各組間ROC曲線面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。IL-6/G+細(xì)菌感染組、IL-6/G-細(xì)菌感染組及IL-10/G-細(xì)菌感染組的敏感度、特異性、約登指數(shù)均高于CRP/G+細(xì)菌感染組和CRP/G-細(xì)菌感染組。上述研究結(jié)果顯示IL-6、IL-10診斷細(xì)菌感染的性能明顯優(yōu)于CRP。

圖1 IL-6、IL-10、CRP診斷細(xì)菌感染的ROC曲線

3.細(xì)菌感染組治療后IL-6、IL-10、CRP表達(dá)水平變化:對41例資料比較完整的細(xì)菌感染組患者進(jìn)行治療前后IL-6、IL-10、CRP數(shù)據(jù)分析顯示，G+細(xì)菌感組IL-6在初診0天、治療后1天、治療后2天、治療后7天表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=146.5,P<0.01)，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。G-細(xì)菌感組IL-6在初診0天、治療后1天、治療后2天、治療后7天表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=142.0,P<0.01)，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。G+細(xì)菌感組IL-10在初診0天、治療后1天、治療后2天、治療后7天表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=85.8,P<0.01)，0天與治療后1天、治療后2天、治療后7天表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初診組與治療后1天、治療后2天、治療后7天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。G-細(xì)菌感組IL-10在初診0天、治療后1天、治療后2天、治療后7天表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=118.7,P<0.01)，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。提示細(xì)菌感患者治療7天后IL-6和IL-10表達(dá)水平迅速恢復(fù)。

表3 IL-6、IL-10、CRP診斷細(xì)菌感染的性能比較

與CRP/G+細(xì)菌感染組比較，*P<0.01;與CRP/G-細(xì)菌感染組比較，#P<0.01

表4 治療后細(xì)菌感染組IL-6、IL-10表達(dá)水平比較[M(P2.5～P97.5)，pg/ml]

與0天比較，*P<0.01;與1天比較，#P<0.01;與2天比較，ΔP<0.01

G+細(xì)菌感染組，CRP在0天、治療后1天、治療后2天、治療后7天 4組間表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=72.3，P<0.01)。CRP分別在0天與治療后1天、2天、7天，治療后1天與治療后7天表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。G-細(xì)菌感染組，CRP在初診、治療后1天、治療后2天、治療后7天4組間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=69.8，P<0.01)。CRP分別在0天與治療后2天、7天，治療后1天與治療后2天、7天、治療后2天與治療后7天表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。治療后7天，IL-6在G+細(xì)菌感染組和G-細(xì)菌感染組表達(dá)水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=1.21、1.71，P均>0.05)，IL-10在G-細(xì)菌感染組表達(dá)水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=0.09，P>0.05)，CRP在G+細(xì)菌感染組和G-細(xì)菌感染組表達(dá)水平與健康對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(U=6.37、6.01，P均<0.01)。細(xì)菌感染患者治療后7天， IL-6和IL-10表達(dá)水平恢復(fù)較CRP 表達(dá)水平恢復(fù)快。

表5 治療后細(xì)菌感染組CRP表達(dá)比較[M(P2.5～P97.5)，mg/L]

與0天比較，*P<0.01;與1天比較，#P<0.01;與2天比較，ΔP<0.01

討 論

目前診斷細(xì)菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌培養(yǎng)，但是其培養(yǎng)周期長，不利于臨床早期診斷和治療，此外細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率不盡理想[5]。當(dāng)前臨床用來快速診斷細(xì)菌感染的檢測指標(biāo)主要是PCT和CRP等。CRP是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激反應(yīng)如急性創(chuàng)傷、腫瘤、心肌梗死等情況下也會(huì)增高，診斷細(xì)菌感染的特異性不足[6]。Jones等[7]對349項(xiàng)PCT研究的Meta分析結(jié)果顯示，PCT對于急診室菌血癥診斷的敏感度和特異性分別僅為76%和70%，且非細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥也會(huì)使PCT增高。因此探尋一種能夠早期、快速、特異的檢測方法鑒別細(xì)菌感染和非感染，顯得尤為迫切。

輔助性 T細(xì)胞(TH細(xì)胞)是機(jī)體內(nèi)最重要的 CD4+T 細(xì)胞亞群，在機(jī)體抵抗外界感染中起到了重要的作用。TH細(xì)胞根據(jù)功能不同可分為 TH1/TH2兩個(gè)亞群，TH1/TH2平衡變化是體內(nèi)炎性反應(yīng)與抗炎反應(yīng)免疫平衡變化的基礎(chǔ)[8～11]。TH1細(xì)胞主要分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ，促進(jìn)CTL的增殖、分化和殺傷作用， TH2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10，增強(qiáng)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體的產(chǎn)生[12,13]。傳統(tǒng)檢測細(xì)胞因子多用ELISA方法，速度慢、操作繁瑣、結(jié)果變異大，不利于臨床常規(guī)檢測。本研究基于流式細(xì)胞術(shù)CBA技術(shù)檢測TH1/TH2細(xì)胞因子，包括IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10。該技術(shù)具有高通量、快速、重復(fù)性好的特點(diǎn)，適宜臨床大樣本分析。

Kitanovshi等[14]研究報(bào)道，IL-6在細(xì)菌感染的中性粒細(xì)胞減少癥患者中具有高敏感度和特異性，并且與患者預(yù)后相關(guān)。Tang等[15,16]在兒童血液腫瘤治療中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染患兒IL-6和IL-10顯著增高，G+細(xì)菌感染組IL-6增高2～10倍以上，G-細(xì)菌感染組IL-6和IL-10同時(shí)增高10倍以上，并且可以據(jù)此鑒別G+細(xì)菌感染或G-細(xì)菌感染。本研究結(jié)果顯示，TH1細(xì)胞因子譜較健康對照組，非細(xì)菌感染組、G+細(xì)菌感染組及G-細(xì)菌感染組均有不同程度的增高，但是中位數(shù)不超過10倍。而TH2細(xì)胞因子譜則顯著增高，其中IL-6在G+細(xì)菌感染組表達(dá)水平較健康對照組中位數(shù)增高10倍以上[14.7倍(121/8.2)]。IL-6和IL-10在G-細(xì)菌感染組表達(dá)水平較對照組中位數(shù)增高遠(yuǎn)超10倍，達(dá)到100倍以上[分別為104.5倍(857/8.2), 220.9倍(751/3.4)]。同期CRP在G+細(xì)菌感染組及G-細(xì)菌感染組雖然亦明顯增高，但中位數(shù)均不超過10倍[分別為8.9倍(36.4/4.1),7.9倍(32.3/4.1)]。本研究結(jié)果顯示，成人組細(xì)菌感染患者也有類似的結(jié)論。

ROC曲線分析顯示，IL-6/G+細(xì)菌感染組，IL-6 最佳cut off值56.3pg/ml，其敏感度為96.36%，特異性為90.48%，約登指數(shù)0.868。IL-6/G-細(xì)菌感染組，IL-6 最佳cut off值235.4pg/ml，其敏感度為96.43%，特異性為97.62%，約登指數(shù)0.941。IL-10/G-細(xì)菌感染組，IL-10 最佳cut off值125.2pg/ml，其敏感度為98.21%，特異性為92.86%，約登指數(shù)0.911。上述結(jié)果表明，IL-6、IL-10在細(xì)菌感染組的曲線下面積(圖1)、敏感度、特異性、約登指數(shù)均顯著高于CRP在細(xì)菌感染組的敏感度、特異性、約登指數(shù)。結(jié)果提示，IL-6、IL-10總體診斷細(xì)菌感染的性能明顯優(yōu)于CRP；IL-6、IL-10不僅有助臨床判斷是否細(xì)菌感染，而且能夠進(jìn)一步鑒別G+細(xì)菌感染和G-細(xì)菌感染。

為了深入探討IL-6和 IL-10在細(xì)菌感染患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究比較了41例G+細(xì)菌感染組和41例G-細(xì)菌感染組患者治療前后IL-6、IL-10及CRP表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示，抗菌治療后第1天，IL-6在G+細(xì)菌感染組，IL-6、 IL-10在G-細(xì)菌感染組患者中的表達(dá)水平均較初診大幅度降低(中位數(shù)降幅在50%以上)，至治療后第2天，IL-6、 IL-10繼續(xù)快速回落，直至第7天基本恢復(fù)至正常水平。而CRP在細(xì)菌感染患者中表達(dá)水平回落則要慢得多，抗菌治療后第1天與初診比較差別并不明顯，至第7天差異才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是其表達(dá)水平仍遠(yuǎn)高于正常表達(dá)水平。究其原因，可能與IL-6、IL-10在血液中的半衰期較CRP半衰期短有關(guān)。上述結(jié)果表明，細(xì)菌感染患者只要抗菌治療有效IL-6和 IL-10就會(huì)迅速降低，有助于臨床療效判斷。

綜上所述，本研究初步顯示，流式細(xì)胞術(shù)CBA技術(shù)檢測TH1/TH2細(xì)胞因子譜診斷細(xì)菌感染的性能優(yōu)于CRP，而且根據(jù)其表達(dá)譜的不同有助于鑒別細(xì)菌感染和非細(xì)菌感染以及G+細(xì)菌和G-細(xì)菌感染，有助于判斷臨床療效。