piR-16744對缺氧—復(fù)氧誘導(dǎo)的小鼠原代心肌細(xì)胞焦亡作用及機(jī)制研究

王 飛，陳鑫哲，王 凱，單 嬋

(青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，青島 266021)

近年，中國心梗患者數(shù)量持續(xù)上升[1]。當(dāng)前有效治療心梗的方法是恢復(fù)缺血心肌血供[2]。大量臨床證據(jù)和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，缺血心肌的血運(yùn)重建時(shí)可能誘發(fā)缺血/再灌注(ischemic/reperfusion, I/R)損傷，影響了再灌注治療的療效[3]。I/R所引發(fā)的心肌損傷伴隨著炎癥的發(fā)生，而細(xì)胞在焦亡過程中亦會(huì)釋放大量炎癥因子[4-5]。細(xì)胞焦亡具有典型的生物學(xué)特征，如細(xì)胞腫脹，明顯的泡狀突出物，消皮素D(Gasdermin D, GSDMD)在質(zhì)膜上穿孔，細(xì)胞膜破碎等，并釋放白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素18(IL-18)等炎癥因子[6-7]。細(xì)胞焦亡的兩條主要信號(hào)調(diào)控通路分別是依賴Caspase-1的經(jīng)典通路和依賴Caspase-4/5(人)、Caspase-11(鼠)的非經(jīng)典通路[8-9]。小鼠生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種長度約為30 nt的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，需要與PIWI(P-element Induced Wimpy Testis)蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)控作用[10]，被命名為Piwi-interacting RNA(piRNA)。后續(xù)piRNA相關(guān)研究逐漸揭示了其在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大[11]、壞死[12]等方面的重要作用。但目前piRNA在心肌細(xì)胞焦亡過程中的作用尚不明確。本研究通過體外構(gòu)建缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation, H/R)小鼠原代心肌細(xì)胞(Primary neonatal mouse cardiomyocytes, NMCs)焦亡模型，探討piR-16744在NMCs焦亡過程中的作用及分子機(jī)制，為緩解和逆轉(zhuǎn)心肌損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

乳鼠(青島大任富成畜牧有限公司)；青霉素與鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)(Dalian Meilun Biotechnology Co., LTD)；膠原酶(Worthington Biochemical Co., Ltd)；胰液素(Sigma Reagents Co., Ltd)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green核酸熒光染料試劑盒(Accurate Biology)；轉(zhuǎn)染試劑(TransGen Biotech)；干擾RNA(small interfering, siRNA)(GenePharma)；LDH Cytotoxicity Assay Kit(LDH)(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)；蛋白裂解液、Propidium Iodide(PI)染液(Beijing solarbio science﹠technology co.,ltd.)；消皮素D(Gasdermin D, GSDMD)、GSDMD-C、Caspase-1、IL-1β和IL-18抗體(ZEN-BIOSCIENCE)；內(nèi)參β-Tubulin、GAPDH抗體(ABclonal)；辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗(Absin)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng)NMCs 使用75%乙醇噴灑小鼠乳鼠，無菌條件下剖取乳鼠心臟，置于磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)中清洗血液后破碎；加入由4%胰液素和1.4%二型膠原酶配制的裂解液，置于37℃水浴中裂解；1 000 r/min離心5 min取上清，過100目篩網(wǎng)，接種于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS，10 g/L的青鏈霉素混合液)中；置于恒溫常氧培養(yǎng)箱(37℃，含95%空氣、5% CO2)1.5 h；上清轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)24 h[13]。

1.2.2 體外構(gòu)建NMCs的H/R模型 細(xì)胞培養(yǎng)12 h，換為無糖無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基；置于恒溫低氧培養(yǎng)箱(37℃，含95% N2和5% CO2)中分別缺氧處理0 h、6 h、12 h、24 h；取出細(xì)胞，更換為正常的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于恒溫常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理6 h[14]。

1.2.3轉(zhuǎn)染及分組NMCs 由吉瑪基因合成過表達(dá)piR-16744的序列記為agomir-piR-16744和敲低piR-16744的序列記為antagomir-piR-16744。NMCs接種于6 cm皿中，12 h后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書的方法分別轉(zhuǎn)染NC、agomir-piR-16744、antagomir-piR-16744，培養(yǎng)24 h至48 h。轉(zhuǎn)染agomir-piR-16744的NMCs需要再進(jìn)行H/R 6/6h的處理。將空白對照組記為A組，H/R組記為B組，轉(zhuǎn)染NC記為C組，轉(zhuǎn)染agomir-piR-16744記為D組，轉(zhuǎn)染antagomir-piR-16744記為E組，共轉(zhuǎn)染antagomir-piR-16744和antagomir-Caspase-1記為F組。piR-16744相關(guān)名稱及序列詳見表1。

表1 piR-16744相關(guān)名稱及序列

1.2.4 細(xì)胞死亡率檢測 去除原細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入適量PI溶液(1∶1 000稀釋)，37℃孵育15 min，PBS清洗3次后在熒光顯微鏡下觀察PI陽性染色比例。取細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，根據(jù)LDH試劑說明書所述方法進(jìn)行溶液配制，450 nm波長下，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中LDH的吸光度值。

1.2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集每組NMCs，提取細(xì)胞中的總蛋白，通過二辛可寧酸法測定每組總蛋白濃度，并調(diào)整至相同濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于TBST封閉液(含5%脫脂奶粉)中室溫1.5 h。洗膜(將膜放在水平搖床上，用TBST洗3次，每次8 min)。使用含5%牛血清白蛋白的TBST稀釋一抗(β-Tubulin、GAPDH，1：10 000稀釋；GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18，1∶1 500稀釋)，4℃搖床過夜孵育。次日洗膜。加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)常溫孵育1.5 h，洗膜。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用軟件Graphpad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NMCs H/R時(shí)間的篩選

設(shè)置6/6 h、12/6 h、24/6 h的缺氧/復(fù)氧時(shí)間梯度，培養(yǎng)NMCs并提取細(xì)胞總蛋白，WB(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測各焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平見圖1?？芍?，在6/6 h時(shí)GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1等焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量較對照組明顯增加，表明NMCs經(jīng)缺氧6 h復(fù)氧6 h處理后發(fā)生明顯焦亡。

圖1 6/6 h后NMCs中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平(a)Western blot檢測各組NMCs中GSDMD和GSDMD-C的蛋白表達(dá)水平；(b)Western blot檢測各組NMCs中Caspase-1的蛋白表達(dá)水平

2.2 piR-16744的表達(dá)變化及其被抑制后的功能

piRNA在心肌祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均有表達(dá)，且在心肌細(xì)胞分化和心肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，如缺失piRNA CHAPIR可顯著改善心肌肥厚并恢復(fù)心臟功能[11]。通過qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)piR-16744在焦亡的NMCs中表達(dá)明顯降低，因此選取其為研究對象，探索其在NMCs焦亡中的作用。E組轉(zhuǎn)染antagomir-piR-16744后piRNA表達(dá)量相較于空白對照組A組降低。E組中GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1、ASC、IL-1β以及IL-18相較于A組和轉(zhuǎn)染NC的C組均明顯增多，表明E組發(fā)生了明顯焦亡。同時(shí)，檢測各組NMCs的死亡率，E組NMCs的死亡率顯著增加。由圖2可知，在NMCs中，抑制piR-16744的表達(dá)可促進(jìn)焦亡的發(fā)生。

圖2 piR-16744的表達(dá)分析及抑制其表達(dá)后的功能驗(yàn)證(a)qPCR檢測piR-16744在H/R后的表達(dá)水平，與0/0 h組比較，P<0.05；(b)轉(zhuǎn)染antagomir后piR-16744的表達(dá)水平；(c)Western blot檢測各組GSDMD和GSDMD-C的蛋白表達(dá)水平；(d)Western blot檢測各組Caspase-1的蛋白表達(dá)水平；(e)Western blot檢測各組ASC的蛋白表達(dá)水平；(f)Western blot檢測各組IL-18的蛋白表達(dá)水平；(g)Western blot檢測各組Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)水平；(h)LDH法檢測細(xì)胞死亡率，與C組比較，P<0.05；(i)PI染色檢測細(xì)胞死亡率，與C組比較，P<0.05

2.3 過表達(dá)piR-16744的功能

過表達(dá)NMCs中piR-16744，研究其對NMCs焦亡的影響。WB檢測焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1以及ASC的表達(dá)水平，見圖3?？芍?，與H/R組B組相比，轉(zhuǎn)染agomir-piR-16744的D組焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)水平均降低，表明D組焦亡水平下調(diào)。同時(shí)，檢測各組NMCs的死亡率，發(fā)現(xiàn)D組NMCs死亡率相較于B組或C組顯著降低，見圖3。綜上，過表達(dá)piR-16744可以抑制因H/R誘導(dǎo)的NMCs焦亡。

圖3 過表達(dá)piR-16744后的功能驗(yàn)證(a)轉(zhuǎn)染agomir后piR-16744的表達(dá)水平。與A組比較，P<0.05；(b)Western blot檢測各組GSDMD和GSDMD-C的蛋白表達(dá)水平；(c)Western blot檢測各組Caspase-1的蛋白表達(dá)水平；(d)Western blot檢測各組ASC的蛋白表達(dá)水平；(e)Western blot檢測各組IL-18的蛋白表達(dá)水平；(f)Western blot檢測各組Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)水平；(g)LDH法檢測細(xì)胞死亡率，與C組比較，P<0.05；(h)PI染色檢測細(xì)胞死亡率，與C組比較，P<0.05

2.4 piR-16744發(fā)揮作用的信號(hào)通路

由圖4可知，E組與A組或C組相比，其焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、GSDMD-C以及炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-18表達(dá)上調(diào)。但相較E組，共轉(zhuǎn)染antagomir-piR-16744和antagomir-Caspase-1的F組中GSDMD、GSDMD-C、IL-1β、IL-18表達(dá)量降低。綜上，在NMCs中，piR-16744通過依賴Caspase-1的焦亡經(jīng)典信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能。

圖4 piR-16744參與的信號(hào)通路驗(yàn)證(a)Western blot檢測各組GSDMD和GSDMD-C的蛋白表達(dá)水平；(b)Western blot檢測各組IL-18、Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表達(dá)水平

3 討論

關(guān)于依賴Caspase-1程序性細(xì)胞死亡的報(bào)道，最早是用福氏志賀氏菌處理小鼠巨噬細(xì)胞后迅速引起細(xì)胞死亡[15]。細(xì)胞死亡命名委員會(huì)于2018年定義焦亡是一種程序性的細(xì)胞死亡方式[16]。GSDMD在焦亡細(xì)胞質(zhì)膜上造成孔洞，水分子進(jìn)入引發(fā)細(xì)胞腫脹，致使質(zhì)膜被快速破壞，細(xì)胞發(fā)生裂解，伴隨大量促炎因子進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境[17-18]，因此細(xì)胞焦亡在多種炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[19-20]。本研究中，H/R 6/6 h時(shí)焦亡現(xiàn)象最為明顯，而其他時(shí)間截點(diǎn)無此現(xiàn)象，可能是誘發(fā)了細(xì)胞凋亡、鐵死亡等其他程序性細(xì)胞死亡方式，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。因此，深入了解細(xì)胞焦亡在疾病中發(fā)揮作用的分子機(jī)制和調(diào)控疾病的機(jī)理，有助于探究疾病產(chǎn)生和發(fā)展過程，開發(fā)用于疾病臨床診斷和治療的新策略。

NcRNA是一類具有廣泛調(diào)控作用的功能性RNA，參與生命體和器官發(fā)育[21-23]及生理病理過程[24-25]，也可被用作心血管疾病的診療靶點(diǎn)和工具，如miR-17-92簇是目前調(diào)控心肌細(xì)胞增殖效果最為顯著的MicroRNA簇之一。它對心肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果在胚胎期至成人期整個(gè)過程都非常明顯，同時(shí)該miRNA對心肌梗死損傷后修復(fù)也具有一定的效果[26-27]；在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，抑制miR-181b表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞TIMP-3的表達(dá)和血管平滑肌細(xì)胞彈性蛋白的產(chǎn)生，從而改善小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[28]；最新研究表明，H/R處理的心肌細(xì)胞和I/R損傷的小鼠心臟中，心肌壞死相關(guān)環(huán)狀RNA(CNEACR) mmu-circ-000338過表達(dá)可緩解由H/R和I/R所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞壞死，使心肌梗死區(qū)域顯著減少，改善心功能[29]。隨著ncRNA相關(guān)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)ncRNA的異常表達(dá)與細(xì)胞焦亡和心腦血管疾病之間具有一定的相關(guān)性[30]。

心肌肥厚期間，缺失piRNA CHAPIR可顯著改善心肌肥厚并恢復(fù)心臟功能，而過表達(dá)piRNA CHAPIR則增強(qiáng)小鼠的病理性肥厚反應(yīng)[11]。此外，在H2O2處理的H9C2心肌細(xì)胞中，抑制piR-10555表達(dá)可改善心肌細(xì)胞壞死的狀況[12]。但目前piR-16744在心肌細(xì)胞焦亡過程中的作用與機(jī)制研究相對較少。因此，探究piR-16744在心血管疾病，特別是I/R損傷中的機(jī)制，有助于深入了解心血管疾病相關(guān)病理生理過程，且具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究在體外構(gòu)建H/R NMCs模型，發(fā)現(xiàn)NMCs在H/R 6/6h時(shí)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著提高，且piR-16744通過依賴Caspase-1的經(jīng)典信號(hào)通路參與調(diào)控H/R誘導(dǎo)的NMCs焦亡。研究結(jié)果可為闡明piRNA調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡和心臟損傷的功能研究提供一定的理論支撐。今后研究仍需探索piR-16744調(diào)控心肌細(xì)胞焦亡的具體分子機(jī)制及其在心血管疾病中的作用。