HIF-1α與MALAT-1在三陰型乳腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性分析

李澤群 何艷 唐劍

廣東深圳市龍崗中心醫(yī)院 1)甲乳血管外科 2)病理科 3)婦科 深圳 518116

三陰型乳腺癌(TNBC)是癌組織中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2(HER-2)均呈陰性表達(dá)的乳腺癌，其發(fā)生率占乳腺癌所有病理類型的10.0%～20.8%。TNBC臨床以侵襲性病程為主要表現(xiàn)，與其他乳腺癌類型比較，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大且預(yù)后較差[1]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是一種具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，主要由HIF-1α與HIF-1β組成，其中α是由缺氧誘導(dǎo)的活性亞基，具有調(diào)節(jié)活性的功能[2]。大量文獻(xiàn)表明[3-4]，HIF-1α能在眾多腫瘤疾病組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤組織的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、放化療的抵抗性等密切相關(guān)。MALAT-1能夠參與并調(diào)控腹膜纖維化的進(jìn)展，且MALAT-1在乳腺癌患者中呈異常表達(dá)，能參與癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖，但目前對于兩者在TNBC患者中的表達(dá)與相關(guān)性研究鮮有。鑒于此，本研究擬分析HIF-1α與MALAT-1在TNBC中的表達(dá)及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性分析2010-10—2020-10我院收治的63例TNBC患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2017年版)》[5]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，ER、PR及Her-2檢查均為陰性。(2)均為女性患者。(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前已接受放化療、內(nèi)分泌等相關(guān)治療者。(2)合并其他部位惡性腫瘤者。(3)妊娠或哺乳期患者。年齡(45.46±8.79)歲(范圍：36～54歲)。臨床TNMⅠ期35例，Ⅱ期22例，Ⅲ期6例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。

1.2方法

1.2.1 MALAT-1染色與判定 采用SP法檢測HIF-1α。對手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行低聚甲醛固定，采用石蠟包埋，連續(xù)切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)，血清封閉后進(jìn)行4℃的孵育過夜。二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色，采用蘇木精進(jìn)行復(fù)染后進(jìn)行反藍(lán)沖洗。采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)代替一抗做陰性對照。結(jié)果以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行判定，若細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)無染色或輕微染色則為陰性；若細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色較強(qiáng)，且陽性細(xì)胞數(shù)比例≥50%，或細(xì)胞核(或細(xì)胞質(zhì))出現(xiàn)強(qiáng)染色且陽性細(xì)胞數(shù)比例≥10%，則為陽性。

1.2.2 引物合成 選擇甘油醛-3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)，所有引物選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)純化級別。MALAT-1上游引物為5’-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T3’；下游引物為5’-TGC CGA CCT CAC GCA GGA TTT T-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為93 bp。HIF-1α上游引物為5’-TCC AAG CCC TCC AGG TAT-3’；下游引物為5’-ATG CTA AAT CCC TCC AAG TAT-3’；下游引物為5’-ATG CTA AAT CGC AGG GTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為568 bp。

1.2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol法提總RNA，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。B-500超微量紫外可見分光光度計(jì)測定RNA濃度，2.0μL5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500ng總RNA，加入10μL RNaes Free ddH2O，PCR儀42℃進(jìn)行2 min水浴。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA放置于-80℃的冰箱中保存待檢，PCR反應(yīng)體積為20 μL，其中SYBR Green PCR Master Mix10μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL；cD-NA模板2 μL，RNase free水為6.8 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共循環(huán)40次。采用2-△△CT法獲得MALAT-1與HIF-1αmRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1HIF-1α蛋白陽性率和MALAT-1、HIF-1α表達(dá)水平癌組織的HIF-1α陽性率高于癌旁組織， MALAT-1、HIF-1α的表達(dá)水平均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 TNBC癌組織與癌旁組織HIF-1α蛋白陽性率及MALAT-1、HIF-1α表達(dá)水平比較

2.2TNBC患者M(jìn)ALAT-1與HIF-1α表達(dá)水平相關(guān)性分析經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，TNBC患者M(jìn)ALAT-1與HIF-1α呈正相關(guān)(r=0.358，P<0.05)。

3 討論

TNBC的病因尚未完全明確，多認(rèn)為與乳腺癌相關(guān)基因(BRCA1/2)導(dǎo)致疾病突變密切相關(guān)。文獻(xiàn)資料表明[6]，乳腺癌患者中部分IncRNA能夠通過對下游靶基因的調(diào)節(jié)作用而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，且能通過與體內(nèi)的受體某些片段DNA結(jié)合對受體的表達(dá)造成影響，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性發(fā)生改變，但仍局限于對乳腺癌組織或細(xì)胞中。因此，尋找新的生物學(xué)標(biāo)記物對了解TNBC的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移機(jī)制，提高TNBC患者的生存率，減少復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，癌組織的HIF-1α陽性率高于癌旁組織，且癌組織MALAT-1和HIF-1α表達(dá)水平高于癌旁組織。結(jié)果提示癌組織的MALAT-1、HIF-1α呈高水平表達(dá)。這可能是由于在腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境中，腫瘤新生血管無法滿足無限增殖的腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而出現(xiàn)氧濃度降低，其中天冬酰氨胺羥化酶(PHDs)、脯氨酸羥化酶(PH)相繼失活，導(dǎo)致下游靶基因HIF-1α轉(zhuǎn)錄被激活。HIF-1作為臨床具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，與靶基因結(jié)合后能夠通過轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生有適應(yīng)代償性質(zhì)，或病理性損害的反應(yīng)。Soni S[7]等通過對HIF-1在生物學(xué)和治療癌癥中近20年重要文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1作為網(wǎng)絡(luò)樞紐可協(xié)調(diào)影響腫瘤發(fā)生的多種信號分子活動，在腫瘤組織的血管生成、能量代謝，以及侵襲轉(zhuǎn)移中有重要的地位。其可在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。Wang Y[8]等通過對Malat-1表達(dá)升高對乳腺癌患者長期不良預(yù)測的Mate分析發(fā)現(xiàn)，其對乳腺癌患者的生存結(jié)局有重要預(yù)測作用，本研究結(jié)果與之近似。進(jìn)一步經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，TNBC患者M(jìn)ALAT-1與HIF-1α呈正相關(guān)。提示HIF-1α表達(dá)水平越高，則MALAT-1的表達(dá)越高。分析原因，可能是由于MALAT-1能夠作用于G2/M細(xì)胞周期，可經(jīng)P13K/mTOR通路對細(xì)胞的增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與TNBC的發(fā)生與發(fā)展[9]。HIF-1α則在低氧反應(yīng)下與反應(yīng)元件結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而呈高水平表達(dá)。

綜上所述，TNBC患者的HIF-1α與MALAT-1的表達(dá)水平呈正相關(guān)，臨床可加強(qiáng)對兩者水平的監(jiān)測，以判斷病情的嚴(yán)重程度。