EZH2 影響炎癥狀態(tài)下人牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的研究*

王鵬程 田 歡 張 正 王左敏

牙周膜干細(xì)胞是從拔除牙齒牙根周組織分離培養(yǎng)而獲得的種子細(xì)胞，可與支架材料和生長因子復(fù)合增殖分化而實(shí)現(xiàn)牙周組織再生[1]。在牙周再生治療過程中，炎癥環(huán)境會(huì)影響PDLSCs 的成骨能力[2]，因此，在炎癥環(huán)境下改變PDLSCs 的成骨能力顯得尤為重要。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要毒力因子，與牙周炎的免疫反應(yīng)有關(guān)[3]，LPS 刺激后的牙周膜細(xì)胞可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶，它們會(huì)導(dǎo)致牙周組織的炎癥浸潤和組織破壞[4-6]。同時(shí)有研究表明，在受到LPS 刺激之后的牙周膜干細(xì)胞，其分化、增殖的潛能也會(huì)受到影響[7]。LPS 介導(dǎo)炎癥發(fā)生、降低牙周膜干細(xì)胞成骨能力，并且可以刺激牙周膜干細(xì)胞來模擬炎癥環(huán)境[8]。

EZH2 是一種多梳蛋白，通過使組蛋白H3 第27 位賴氨酸(H3K27)三甲基化修飾，達(dá)到抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞分化和增殖異常，引起一系列疾病的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型中通過抑制EZH2，可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力[9]，而EZH2 是否是PDLSCs成骨分化的靶點(diǎn)還不得而知。本研究使用LPS 刺激模擬炎癥環(huán)境，靶向敲低PDLSCs 中EZH2，檢測其成骨能力變化，探討EZH2 對炎癥狀況下PDLSCs 成骨能力的影響，以期為臨床提供參考。

1.材料與方法

1.1 PDLSCs 的分離、培養(yǎng)與鑒定 選自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院口腔科阻生齒拔除患者中獲得健康磨牙(已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。分離牙周膜組織，用0.2%膠原酶(Gibco，美國)在37℃處理2h后用0.25%胰蛋白酶消化30min。然后將單細(xì)胞懸液在含有100μg/ ml 鏈霉素(Beyotime，中國)、100U/ ml 青霉素(Beyotime，中國)的α-MEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)中在37℃和5%CO2條件下孵育。將第3-5 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取第三代牙周膜干細(xì)胞使用PBS 洗1 遍，常規(guī)胰酶消化，最終調(diào)整細(xì)胞密度(1×106/ ml)，分裝至無菌EP 管中(1.5mL)。分別加入Alexa Fluor 647、FITC 或PE 直接熒光標(biāo)記的抗人Stro-1，CD14 和CD45 抗體(Santa Cruz，美國)。利用同型抗體進(jìn)行對照。冰上避光孵育1.5h，1000rpm 離心3min，小心棄掉上清，應(yīng)用PBS 洗滌3 遍，加入含3%胎牛血清的PBS 重懸，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。選取對數(shù)生長期的牙周膜干細(xì)胞，使用胰酶消化之后制成細(xì)胞懸液，稀釋為1×106、5×106、5×107個(gè)/ L 的單細(xì)胞懸液，將每種濃度的懸液選取1ml 均勻鋪平在直徑為10cm 的培養(yǎng)皿中，隨后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 日換一次液。14d 后終止培養(yǎng)，PBS 清洗3 遍后使用4%多聚甲醛固定30min，使用PBS 再次清洗3 遍后使用0.2%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，染色15min 后使用PBS 再次沖洗，室溫下干燥。鏡下，以大于等于50 個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)集落進(jìn)行觀察。

1.2 siRNA 的合成與轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)參照Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)細(xì)胞轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。細(xì)胞消化分孔(6 孔板)，兩個(gè)離心管分別加入100ul RPMI-1640(Gibco，美國)，1 號離心管加入Lipofectamine 2000，2 號離心管加入1ug DNA(100pmol siRNA)。將脂質(zhì)體稀釋液加入至2 號離心管，RPMI-1640 過洗一遍轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，加入RPMI-1640 0.8ml/ 孔。siRNA 轉(zhuǎn)染設(shè)置空白對照組和陰性對照，過表達(dá)轉(zhuǎn)染設(shè)置空白對照和空載轉(zhuǎn)染組。將DNA-脂質(zhì)體(siRNA-脂質(zhì)體)混合物加入培養(yǎng)皿，放入37℃，5%CO2溫箱中孵育。5h后，換10%FBS-RPMI1640 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 siEZH2 效率驗(yàn)證 Western Blot 檢測三組牙周膜干細(xì)胞EZH2 轉(zhuǎn)染后siEZH2-1、siEZH2-2、siEZH2-3 轉(zhuǎn)染效率，選取其中轉(zhuǎn)染效率最高的一組進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

使用LPS 刺激牙周膜干細(xì)胞、空轉(zhuǎn)牙周膜干細(xì)胞siNC 和已敲減EZH2 的牙周膜干細(xì)胞siEZH2，驗(yàn)證在LPS 刺激情況下EZH2 基因的轉(zhuǎn)染抑制是否受到影響。

1.4 Western Blot LPS 模擬炎癥環(huán)境時(shí)PDLSCs 中EZH2 表達(dá)的變化：使用不同濃度LPS刺激牙周膜干細(xì)胞48h，細(xì)胞分組：1.牙周膜干細(xì)胞組；2.牙周膜干細(xì)胞+LPS 刺激組(1μg/ ml)；3.牙周膜干細(xì)胞+LPS 刺激組(5μg/ ml)；4.牙周膜干細(xì)胞+LPS 刺激組(10μg/ ml)，Western Blot檢測EZH2 表達(dá)變化，篩選出LPS 的最適濃度。

使用最適濃度的LPS 刺激牙周膜干細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞分組：1.牙周膜干細(xì)胞組；2.牙周膜干細(xì)胞+LPS 刺激(12h)組；3.牙周膜干細(xì)胞+LPS刺激(24h)組；4.牙周膜干細(xì)胞+LPS 刺激(48h)，Western Blot 檢測EZH2 表達(dá)變化，篩選出LPS的最刺激時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

檢測成骨蛋白表達(dá)時(shí)分組如下：①對照組：牙周膜干細(xì)胞；②實(shí)驗(yàn)組：siNC+LPS；③實(shí)驗(yàn)組：siEZH2+LPS。實(shí)驗(yàn)組空轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)染EZH2 后的牙周膜干細(xì)胞在使用方法1.2 得出的LPS 濃度和時(shí)間刺激后，在成骨誘導(dǎo)14d 后裂解細(xì)胞進(jìn)行Western Blot 檢測。

各組常規(guī)裂解細(xì)胞，取上清液進(jìn)行蛋白定量(Beyotime，中國)，進(jìn)行10%SDS-PAGE(Solarbio,中國)凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Millipore，美國)，TBST 液洗滌印跡膜5 min 3 次。5%脫脂奶粉室溫封閉1h。加入EZH2(CST，# 5246)、Runx2(Abcam,ab236639)、ALP (Abcam,ab133602)、OCN(Abcam,ab133612)和GAPDH(Cell Signaling Technology,美國)抗體，4℃過夜。棄一抗，TBST 洗滌15min 3 次。加二抗抗體，室溫1h。最后ECL 顯色(Beyotime，中國)評估蛋白質(zhì)條帶。

1.5 茜素紅染色 實(shí)驗(yàn)分組：(1)對照組：牙周膜干細(xì)胞；(2)實(shí)驗(yàn)組：siNC+LPS；(3)實(shí)驗(yàn)組：si EZH2+LPS。

按照廠商說明書(Cyagen，美國)進(jìn)行，牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ ml 青霉素、100 U/ ml 鏈霉素的a-MEM 培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中以5%CO2、37 ℃以及飽和濕度條件下松蓋培養(yǎng)，每1～2d 換液一次，當(dāng)細(xì)胞長至80%鋪滿時(shí)再消化傳代。

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液：地塞米松10nmol/ L,B-甘油磷酸鈉10mM/ L,抗壞血酸50μg/ ml，雙抗，a-MEM 培養(yǎng)基，10%FBS。每3d 換液一次(半換液)，21d 后吸去培養(yǎng)液，用PBS 清洗兩次，用4%多聚甲醛固定30min。用去離子水清洗1 次，之后2%茜素紅染色液染色20min～30min，拍照。在拍照之后進(jìn)行脫色處理(每孔加300ul 5%的高氯酸溶液，在搖床上溫和搖床15min,然后在吸取100ul脫色液到96 孔板，用酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)，記下OD值,檢測波長490nm)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 SPSS 19.0(IBM Corp.) 統(tǒng)計(jì)軟件用于數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism V(GraphPad Software,Inc.) 用于圖像編輯。測量數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用非配對t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。使用單向方差分析和Tukey 事后檢驗(yàn)確定多個(gè)組之間的差異。P<0.05 被認(rèn)為表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2.結(jié)果

2.1 牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用改良組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至8～10天時(shí)鏡下觀查可見長梭形、成纖維樣細(xì)胞在組織塊周圍較密集排列(圖1)。

圖1 原代培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞(×40)

鏡下觀察使用結(jié)晶紫染色的牙周膜干細(xì)胞呈長梭形集落樣生長，細(xì)胞體積較小，排列緊湊，細(xì)胞簇中心細(xì)胞密度越大(圖2)。

圖2 牙周膜干細(xì)胞克隆形成(×100)

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明原代培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物stro-1，陰性表達(dá)單核巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD14、造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45(圖3)。證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的克隆化細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測牙周膜干細(xì)胞表面相關(guān)抗原

2.2 不同濃度與時(shí)間的LPS 對PDLSCs 刺激后EZH2 的表達(dá)變化 LPS 濃度為10μg/ ml 時(shí)EZH2 表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，選擇10μg/ ml LPS 進(jìn)行下一步研究(圖4)。LPS刺激48h 后EZH2 表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖5)。

圖4 不同濃度(1μg/ ml、5μg/ ml 和10μg/ ml)LPS刺激后PDLSCs 中EZH2 表達(dá)變化(*P<0.05)

圖5 LPS 刺激PDLSCs 不同時(shí)間(12h，24h 和48h)后EZH2 表達(dá)變化(**P<0.01)

2.3 EZH2 敲低后PDLSCs 中EZH2 的表達(dá)為了研究EZH2 的作用，用siRNA 轉(zhuǎn)染抑制EZH2表達(dá)。通過Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)siRNA 轉(zhuǎn)染后PDLSCs 中EZH2 的蛋白水平顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，尤其是在si-EZH2-3 中，差異最為顯著(P<0.01)(圖6)，根據(jù)Western Blot 檢測結(jié)果灰度分析：三組的EZH2 蛋白水平的表達(dá)率分別為68%、73%、41%，選擇siEZH2-3 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 EZH2 敲低后PDLSCs 中EZH2 表達(dá)水平變化(*P<0.05，**P<0.01)

siNC 組在LPS 刺激后EZH2 表達(dá)顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，敲低EZH2 后顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的EZH2 表達(dá)的上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖7)。

圖7 LPS 刺激EZH2 敲低后PDLSCs 中EZH2 表達(dá)水平變化(*P<0.05，**P<0.01)

2.4 EZH2 敲低對LPS 刺激下PDLSCs 中成骨蛋白Runx2、ALP、OCN 表達(dá)影響 各組加刺激并成骨誘導(dǎo)14d 后，Western Blot 檢測結(jié)果顯示LPS 顯著抑制PDLSCs 中RUNX2、ALP 和OCN 水平，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)；與LPS 組相比，EZH2 敲低后PDLSCs 中Runx2、ALP 和OCN 表達(dá)水平顯著提高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖8)。

圖8 LPS 刺激EZH2 敲低后PDLSCs 中Runx2、ALP 和OCN 表達(dá)水平變化(*P<0.05，**P<0.01)

2.5 EZH2 敲低后LPS 刺激下PDLSCs 茜素紅染色 茜素紅染色結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)28d 后，LPS+siNC 組較對照組深紅色礦化結(jié)節(jié)減少，說明LPS 刺激后牙周膜干細(xì)胞成骨能力降低；siEZH2組較siNC 組深紅色礦化結(jié)節(jié)顯著增多，說明EZH2敲低后炎癥狀態(tài)下牙周膜干細(xì)胞成骨能力增強(qiáng)。再次驗(yàn)證EZH2 敲低后可以減輕炎癥狀態(tài)PDLSCs的成骨抑制(圖9)。

圖9 EZH2 敲低后LPS 刺激下PDLSCs 茜素紅染色對照組肉眼觀(A)及對照組鏡下觀(D)；LPS+siNC 成骨誘導(dǎo)茜素紅染色肉眼觀(B)及鏡下觀(E)；LPS+siEZH2 成骨誘導(dǎo)茜素紅染色肉眼觀(C)及鏡下觀(F)

3.討論

PDLSCs 是牙周組織工程中理想的牙周再生種子細(xì)胞，有學(xué)者從炎癥的牙周組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞后[10]，大大增加了種子細(xì)胞的來源。在臨床應(yīng)用階段，種子細(xì)胞在牙周組織再生的過程往往也伴隨著一定程度的炎癥。細(xì)菌的定植和隨后伴隨的宿主免疫反應(yīng)形成了一個(gè)特定的炎癥微環(huán)境，這通常會(huì)影響PDLSCs 的功能[11]。有研究表明，不同牙周致病菌分泌的細(xì)菌上清液會(huì)誘導(dǎo)PDLSCs 產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致局部牙周組織破壞，在這些病原體存在的情況下，PDLSCs 的遷移、增殖和成骨功能都會(huì)受到影響[12]。本實(shí)驗(yàn)采用改良組織塊法進(jìn)行PDLSCs 原代培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定干細(xì)胞表面抗原，證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的克隆化細(xì)胞具有間充質(zhì)來源[13]。

表觀遺傳調(diào)控包括DNA 甲基化、微小RNA修飾、組蛋白乙?；烷L鏈非編碼RNA 修飾，越來越多研究表明牙周炎與表觀遺傳修飾有關(guān)[14]。EZH2是PRC2 復(fù)合物的核心催化亞基，在調(diào)節(jié)廣泛的生物過程中起著關(guān)鍵作用，包括惡性腫瘤發(fā)展、干細(xì)胞更新和發(fā)展、免疫反應(yīng)和細(xì)胞衰老，它通過催化基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)組蛋白H3 上賴氨酸27 的三甲基化來介導(dǎo)基因沉默[15]。EZH2 對于干細(xì)胞的維持和分化很重要。在間充質(zhì)干細(xì)胞分化方面，EZH2 抑制成骨并促進(jìn)脂肪生成。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)對EZH2 的抑制導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[16]。同樣，還有研究表明，使用EZH2化學(xué)酶抑制和shRNA 敲低也是間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的調(diào)節(jié)劑[17]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們使用LPS 模擬炎癥環(huán)境，使用1μg/ ml、5μg/ ml 和10μg/ ml 濃度的LPS 分別刺激牙周膜干細(xì)胞，EZH2 表達(dá)隨濃度升高表達(dá)增強(qiáng)，并且以時(shí)間依賴性趨勢表達(dá)逐漸增強(qiáng)，這與Cheng 等[18]的體外研究結(jié)果相似，最終我們選取了10μg/ ml 濃度的LPS，刺激時(shí)間為48 小時(shí)進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步研究在炎癥環(huán)境下EZH2對牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響，我們通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染抑制了牙周膜干細(xì)胞中EZH2 的表達(dá)，再次使用LPS 刺激后，EZH2 水平顯著降低，說明siEZH2 可以抑制因?yàn)長PS 刺激而進(jìn)引起牙周膜干細(xì)胞中EZH2 升高。

成骨分化能力是牙周膜干細(xì)胞的重要特性，炎癥環(huán)境會(huì)影響牙周膜干細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)使用10μg/ ml 的LPS 對牙周膜干細(xì)胞刺激后，牙周膜干細(xì)胞Runx2、ALP、OCN 表達(dá)均有降低。Runx2、ALP、OCN 是衡量成骨功能的重要因子，在成骨細(xì)胞分化的早期，Runx2 不僅是起決定性作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，還是體內(nèi)成骨的必需轉(zhuǎn)錄因子。有研究顯示將小鼠的Runx2 基因敲除后將無法形成礦化的骨骼系統(tǒng)，從而導(dǎo)致在圍產(chǎn)期發(fā)生死亡現(xiàn)象[19]。ALP 是由成骨細(xì)胞分泌的一種酶，它的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)非常明顯的特征之一。骨鈣素OCN 是一種由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞合成的小蛋白，是骨骼中含量最豐富的非膠原蛋白之一[20,21]。

EZH2 會(huì)影響牙周膜干細(xì)胞的成骨功能，這可能與EZH2 對H3K27me3 的甲基化作用有關(guān)，有研究證實(shí)[22]：LPS 刺激牙周膜干細(xì)胞后不僅Runx2基因表達(dá)下調(diào)，并且LPS 對Runx2 的這種抑制作用與基因啟動(dòng)子上H3K27me3 的富集增加有關(guān)。H3K27me3 在Runx2 基因啟動(dòng)子上的占據(jù)似乎在成骨過程中起關(guān)鍵作用，因?yàn)镠3K27me3 的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶均調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們抑制EZH2 后，再次使用LPS 刺激牙周膜干細(xì)胞，其成骨蛋白ALP、Runx2、OCN 表達(dá)較shNC 組顯著升高，說明抑制EZH2后恢復(fù)了因?yàn)檠装Y環(huán)境引起的牙周膜干細(xì)胞成骨能力的下降，茜素紅染色也再次驗(yàn)證了這一點(diǎn)。因此我們猜測是否是因?yàn)镋ZH2 影響了LPS 介導(dǎo)的某條通路的關(guān)鍵蛋白，降低了LPS 對牙周膜干細(xì)胞成骨功能的抑制。

4.結(jié)論

靶向敲低EZH2 后，可以減少因LPS 刺激所引起的牙周膜干細(xì)胞中Runx2、ALP、OCN 蛋白表達(dá)下降和成骨能力降低。