不同種植年限對(duì)花椒根際土壤理化性質(zhì)和微生物群落的影響

廖禮彬 石福孫* 張楠楠 陳曉霞 補(bǔ)歡歡 孫福勇

（1. 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041；2. 阿壩州生態(tài)保護(hù)與發(fā)展研究院，汶川 623000）

植物根際一般是指根系及其周圍的土壤環(huán)境，根系、根際土壤及土壤中的微生物組成的根際微生態(tài)系統(tǒng)對(duì)于維持植物的健康生長(zhǎng)具有重要作用。對(duì)于大田種植作物來說，根際土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)等常隨著作物種植年限的延長(zhǎng)而發(fā)生惡化，從而影響根際微生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)與能量循環(huán)，導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降。研究表明，土壤理化性質(zhì)惡化、根際微生物區(qū)系失衡、自毒物質(zhì)積累等因素是導(dǎo)致作物連作障礙、病害發(fā)生的重要因素，而微生物群落失衡則是其中最主要的因素。

花椒（Maxim.）為蕓香科（Rutaceae）花椒屬（）植物，原產(chǎn)我國(guó)，具有抗干旱、耐瘠薄、根系發(fā)達(dá)等生物學(xué)特性，是重要的調(diào)味品、香料及木本油料樹種?；ń肥且环N生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)作物，在一些椒園中常可見樹齡30年以上的花椒樹。隨著種植年限的增加，花椒根腐病的發(fā)生和危害也愈發(fā)嚴(yán)重，如在種植5年以上的花椒園中，根腐病的發(fā)病率可達(dá)45%以上，造成大批成年花椒樹死亡甚至毀園，且再植的花椒幼苗也難以存活。有關(guān)種植年限對(duì)花椒根際微生態(tài)及功能影響的研究已有一些報(bào)道，張文娟等的研究表明長(zhǎng)期種植花椒增加了土壤有機(jī)碳的礦化量，降低了土壤有機(jī)碳的穩(wěn)定性；楊睿等發(fā)現(xiàn)種植年限影響了花椒根際土壤細(xì)菌群落的多樣性，土壤pH、速效磷隨種植年限增加逐漸升高，而有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮等指標(biāo)先降后升。

岷江干旱河谷區(qū)域是花椒的傳統(tǒng)種植區(qū)及主產(chǎn)區(qū)，花椒是當(dāng)?shù)乩习傩赵鍪罩赂坏囊环N重要經(jīng)濟(jì)作物。該區(qū)域四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣段的花椒種植長(zhǎng)期以來遭受著根腐病的嚴(yán)重危害，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)鼗ń返漠a(chǎn)量和品質(zhì)，花椒根腐病已成為當(dāng)?shù)鼗ń樊a(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。因此，開展不同種植年限對(duì)花椒根際土壤理化性質(zhì)和微生物群落影響的研究，對(duì)花椒根腐病防治和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。磷脂脂肪酸（PLFAs）生物標(biāo)記分析法是目前研究微生物群落的經(jīng)典方法之一，其分析基于的磷脂脂肪酸是生物活細(xì)胞中重要的膜組分，在細(xì)胞死亡后會(huì)快速降解，因此相對(duì)于其他方法在響應(yīng)微生物群落中活菌的變化上更為敏感。因此，本研究利用PLFAs 方法分析比較不同種植年限的花椒（1、15、30 a）的根際土壤微生物群落的變化，結(jié)合土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性分析，探討土壤微生物群落及理化性質(zhì)隨種植年限的變化趨勢(shì)，以期為花椒根腐病的防治、椒園改造等提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年8月，于四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣，在同一坡地中且耕作管理措施相同的3個(gè)鄰近花椒園內(nèi)（31°45′51″N，103°43′52″E，海拔2 200 m），分別選擇種植年限為1、15、30 a的花椒植株各6株，采集根際土壤。每個(gè)花椒園中分別隨機(jī)選取生長(zhǎng)狀況大致相同的花椒樹，在選定的花椒植株主干10～50 cm范圍內(nèi)，清除凋落物，用鋤頭挖土并找到根系，采用抖落法采集10～30 cm深度的根際土壤，每株花椒根部均在4個(gè)方向取土，混勻?yàn)橐粋€(gè)土樣后裝入自封袋中，作為該株花椒的根際土壤，然后放入冰盒中保存帶回實(shí)驗(yàn)室；樣品在實(shí)驗(yàn)室去除動(dòng)植物殘?bào)w及石塊等異物后分成2份，一份立即開始土壤理化與酶活性分析測(cè)定，另一份于冰箱中?20℃保存，用于土壤微生物磷脂脂肪酸檢測(cè)。

1.2 測(cè)定方法

土壤pH值使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，（土）∶（水）=1∶10；土壤總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）采用元素分析儀（德國(guó)元素公司:Variou Macro cube）測(cè)定；銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen）采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；速效磷（Available phosphorus，AP）采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀（Available potassium，AK）采用乙酸銨浸提—火焰光度法測(cè)定。

蔗糖酶（Sucrase）活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，以24 h 后1 g 土壤中葡萄糖含量表示；脲酶（Urease）活性采用次氯酸鈉?苯酚鈉靛酚藍(lán)比色法測(cè)定，以24 h 后1 g 土壤中NH-N 的含量表示；酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，以24 h 后1 g 土壤中酚的釋放量表示；多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用鄰苯三酚比色法測(cè)定，以2 h 后1 g 土壤中紫色沒食子素的含量表示。

稱取4 g 凍干土樣，采用氫氧化鉀?甲醇溶液甲酯化法分離提取，用十九烷酸為內(nèi)標(biāo)，使用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)HP GC7890/MS5975）得到PLFA特征圖譜，再根據(jù)內(nèi)標(biāo)計(jì)算PLFA含量（μg·g）參考已有研究成果中的磷脂脂肪酸標(biāo)記物表征根際土壤中的微生物（見表1）。

表1 表征微生物的磷脂脂肪酸（PLFA）標(biāo)志物Table 1 The PLFA biomarkers used to characterize microbes

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同種植年限花椒根際土壤微生物群落特征用所測(cè)得PLFA 數(shù)據(jù)計(jì)算多樣性指數(shù)：香農(nóng)?維納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index，）、辛普森多樣性指數(shù)（Simpson diversity index，）和Pielou 均勻度指數(shù)（Pielou evenness index，）計(jì)算公式如下：

式中：N為第種磷脂脂肪酸含量；為磷脂脂肪酸標(biāo)記物總量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，利用SPSS 20.0 軟件對(duì)不同種植年限花椒根際土壤理化性質(zhì)、酶活性、PLFA 含量、多樣性指數(shù)等進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并用LSD 方法比較不同種植年限之間的差異，顯著水平為<0.05，采用Pearson 系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。作圖通過OriginPro 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)與酶活性變化

從表2 可知，隨著種植年限的增加，花椒根際土壤的pH值出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，30 a時(shí)土壤pH值最低（pH=6.77），根際土壤由弱堿性向弱酸性變化。土壤速效磷和速效鉀含量隨種植年限呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，30 a 時(shí)土壤速效磷和速效鉀含量與1 a 相比分別顯著增加了127.87%和181.45%（<0.01）。蔗糖酶和脲酶活性隨種植年限增加呈先增后降的趨勢(shì)，15 a的活性最大，分別為1 026.75和69.01 μg·g。多酚氧化酶活性隨種植年限的增加逐漸降低，15、30 a 時(shí) 分 別 顯 著 降 低 了39.24% 和62.82%（<0.01）。土壤總有機(jī)碳、銨態(tài)氮、酸性磷酸酶和過氧化氫酶活隨種植年限的增加無顯著性變化。

表2 不同種植年限花椒根際土壤理化性質(zhì)與酶活性Table 2 Physiochemical properties and enzyme activities of rhizosphere soil of Z.bungeanum of different planting years

2.2 土壤微生物PLFA含量與群落結(jié)構(gòu)變化

不同種植年限花椒根際土壤微生物PLFA 含量的變化如圖1 所示，土壤微生物總PLFA、真菌、革蘭氏陰性細(xì)菌（G）PLFA 含量隨種植年限增加呈增加趨勢(shì)，且在15 a 時(shí)已顯著增加（<0.05）。與1 a土壤相比，15 和30 a 時(shí)土壤真菌含量分別顯著增加了44.03%和81.26%（<0.05），G含量分別顯著增加了49.63% 和58.20%（<0.05）。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（G）和放線菌PLFA 含量隨種植年限增加呈先增再降趨勢(shì)，G在15a 時(shí)最高（151.71 μg·g）、30 a 時(shí)最低（90.29 μg·g），放線菌在15 a時(shí)最高（15.21 μg·g）、30 a 時(shí)最低（6.90 μg·g）。土壤細(xì)菌PLFA 含量隨種植年限的增加無顯著性變化。

圖1 不同種植年限花椒根際土壤微生物類群磷脂脂肪酸含量數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示差異顯著（LSD，P<0.05），下同F(xiàn)ig.1 Microbial group PLFA contents in Z.bungeanum rhizosphere soil of different planting years Values are mean±SE，the different lowercase letters indicate significant difference（sLSD，P<0.05），the same as below

不同種植年限花椒根際土壤微生物生物量比值變化如圖2 所示。細(xì)菌/真菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌/革蘭氏陰性細(xì)菌（G/G）隨種植年限增加呈下降趨勢(shì)，與1a相比，到30a時(shí)細(xì)菌/真菌比值顯著下降了34.14%（<0.01），G/G比值顯著下降了38.87%（<0.01）。細(xì)菌/放線菌和真菌/放線菌隨種植年限增加呈先下降再升高趨勢(shì)，均為1 a 最大、15 a 最小，且均為1 和15 a 間差異顯著（<0.05）。不同種植年限花椒根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)如表3 所示，隨種植年限增加，香農(nóng)?維納多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均以1 a最低、15 a最高，但不同年限間無顯著差異。

圖2 不同種植年限花椒根際土壤不同微生物類群磷脂脂脂酸度含量的比值Fig.2 Ratios of different microbial group PLFA contents in Z. bungeanum rhizosphere soil of different planting years

2.3 土壤微生物的多樣性以及土壤微生物與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

對(duì)不同種植年限花椒根際土壤微生物類群與土壤理化性質(zhì)及酶活性之間的相關(guān)性分析結(jié)果如表3所示，土壤環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著相關(guān)性（<0.05）。土壤pH 值與總PLFA、G、真菌、細(xì)菌、放線菌呈顯著負(fù)相關(guān)，與G/G呈顯著正相關(guān)；總有機(jī)碳與G、放線菌呈顯著正相關(guān)，與真菌/放線菌呈極顯著負(fù)相關(guān)。銨態(tài)氮與G呈顯著正相關(guān)；速效磷和速效鉀均與總PLFA、G、真菌呈顯著正相關(guān)，與G/G呈極顯著負(fù)相關(guān)。蔗糖酶與放線菌呈顯著正相關(guān)，與細(xì)菌/放線菌、真菌/放線菌呈顯著負(fù)相關(guān)；脲酶與G呈顯著正相關(guān)；多酚氧化酶與真菌呈顯著負(fù)相關(guān)，與細(xì)菌/真菌、G/G呈顯著正相關(guān)。酸性磷酸酶、過氧化氫酶與微生物類群及其比值均無顯著相關(guān)關(guān)系。

表3 不同種植年限花椒根際土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of microbial community in Z.bungeanum rhizosphere soil of different planting years

3 討論

根際微生態(tài)系統(tǒng)是植物與土壤之間相互作用最為直接的場(chǎng)所，土壤、根系和微生物三者在其中緊密結(jié)合又相互影響，是物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動(dòng)的活躍區(qū)域，土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是反映該系統(tǒng)正常與否的關(guān)鍵指標(biāo)。研究表明，作物的長(zhǎng)期單一種植會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，導(dǎo)致作物養(yǎng)分供給與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，進(jìn)而影響作物的正常生長(zhǎng)。

表4 不同種植年限花椒根際土壤微生物生物量與環(huán)境因子的相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of soil microbes and environmental factors in Z. bungeanum rhizosphere soil of different planting years

3.1 土壤理化性質(zhì)變化

本研究表明花椒根際土壤的pH 隨種植年限的增加呈降低趨勢(shì)，這與劉嬌嬌等的研究結(jié)果相一致。花椒根際土壤隨種植年限增加由弱堿性向弱酸性轉(zhuǎn)變，這可能是有機(jī)酸等根系分泌物在根際土壤中的不斷積累導(dǎo)致的。部分研究者發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤中有效養(yǎng)分含量出現(xiàn)降低，但也有研究發(fā)現(xiàn)連作導(dǎo)致土壤養(yǎng)分上升而出現(xiàn)累積效益，如吳林坤等發(fā)現(xiàn)重茬地黃（）根際土壤中速效磷與速效鉀含量顯著高于頭茬和野生狀態(tài)土壤，但重茬地黃生長(zhǎng)不良、病害嚴(yán)重；王茂勝等發(fā)現(xiàn)隨種植年限增加，植煙的品質(zhì)和產(chǎn)量出現(xiàn)下降，而土壤中全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)的含量逐漸增加。本研究發(fā)現(xiàn)根際土壤速效磷與速效鉀隨種植年限延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，這可能是由于隨著花椒的生長(zhǎng)，根系分泌酸類、植酸酶等的增多有效促進(jìn)了難溶性養(yǎng)分轉(zhuǎn)化成速效養(yǎng)分，但高種植年限的花椒樹體開始衰老導(dǎo)致養(yǎng)分吸收功能出現(xiàn)明顯降低，從而引起了根際土壤速效磷與速效鉀含量的顯著增加。

3.2 土壤酶活性變化

土壤酶活性能夠反應(yīng)土壤生物活性，體現(xiàn)土壤化學(xué)性質(zhì)的轉(zhuǎn)化能力，是衡量土壤肥力水平與質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)靈敏指標(biāo)。蔗糖酶活性可以表征土壤碳氮轉(zhuǎn)化的速率、反映土壤的熟化程度和肥力水平；脲酶活性可表示土壤氮素的供應(yīng)水平與能力；多酚氧化酶為抗性酶且參與腐殖質(zhì)的形成。本研究中，蔗糖酶活性、脲酶活性隨種植年限增加呈先增后降的趨勢(shì)，均在15 a 時(shí)活性最高，與趙帆等的研究結(jié)果相似?；ń肪哂谢凶饔们以谏L(zhǎng)過程中化感物質(zhì)會(huì)在土壤中累積并影響土壤酶活性，從而導(dǎo)致了花椒根際土壤的碳氮轉(zhuǎn)化速率以及氮素供應(yīng)水平在15 a 時(shí)達(dá)到頂峰后又開始下降。馬云華等的研究結(jié)果顯示低濃度酚酸類物質(zhì)使多酚氧化酶活性上升，但高濃度酚酸類物質(zhì)顯著降低其活性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，多酚氧化酶活性隨種植年限增加出現(xiàn)了持續(xù)的下降，說明隨著種植年限的增加，花椒根際土壤中酚酸類物質(zhì)濃度可能逐漸升高從而使多酚氧化酶活性下降，導(dǎo)致了花椒根際土壤的抗性和腐殖質(zhì)形成能力不斷減弱。

3.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

土壤微生物對(duì)維持土壤系統(tǒng)穩(wěn)定性、健康和質(zhì)量十分關(guān)鍵，土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成會(huì)直接影響土壤功能的發(fā)揮。土壤中細(xì)菌/真菌可以反映土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)不同土壤條件的響應(yīng)。本研究中，隨種植年限增加，花椒根際土壤真菌含量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，細(xì)菌/真菌顯著下降，這與一些研究結(jié)果一致。長(zhǎng)期種植單一作物會(huì)誘導(dǎo)土壤真菌尤其是土傳病害致病真菌的增加，且真菌比細(xì)菌更能適應(yīng)養(yǎng)分貧瘠、酸化的土壤條件，種植年限的增加可能促使花椒根際土壤微生物群落從“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，可能導(dǎo)致真菌病害的發(fā)生和加重。G細(xì)菌偏向于利用新鮮有機(jī)碳，而G細(xì)菌更傾向于使用土壤有機(jī)質(zhì)衍生碳，其比值可以用來指示土壤碳的有效性或土壤營(yíng)養(yǎng)狀況，張冰冰等的研究表明杉木（）人工林土壤G/G會(huì)隨著土壤碳有效性的增加而降低?；ń犯H土壤中G/G隨種植年限增加呈顯著下降趨勢(shì)，表明花椒根際土壤碳的有效性可能隨種植年限延長(zhǎng)而增加。楊睿等對(duì)花椒根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)耐受菌大部分為G細(xì)菌，而致病菌多屬于G菌；Yao 等在高種植年限茶樹土壤中分離到大量低代謝能力G菌。本研究中花椒根際土壤G/G的變化趨勢(shì)也表明隨著種植年限增加低代謝能力的微生物類群數(shù)量增加，根際氧化脅迫耐受菌占比下降使得花椒抗病原菌侵染的能力下降，花椒受到病原菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)增大。相關(guān)性分析顯示土壤pH 值、速效磷、速效鉀與總PLFA、G、真菌、G/G呈顯著相關(guān)關(guān)系，多酚氧化酶活性與真菌、細(xì)菌/真菌呈顯著相關(guān)關(guān)系，說明隨著種植年限的增加，花椒根際土壤pH、速效磷、速效鉀、多酚氧化酶的變化是影響土壤微生物群落與組成的主要環(huán)境因子，真菌和G的增加及多酚氧化酶活性的降低可能是誘導(dǎo)花椒根腐病發(fā)生的重要原因。

4 結(jié)論

綜上所述，花椒根際土壤理化性質(zhì)、酶活和微生物群落結(jié)構(gòu)隨種植年限的延長(zhǎng)發(fā)生了顯著變化。土壤pH 值和多酚氧化酶呈下降趨勢(shì)，土壤速效鉀和速效磷呈增加趨勢(shì)。土壤微生物總PLFA、G、真菌PLFA 含量隨種植年限增加呈增加趨勢(shì)，G和放線菌PLFA 含量呈先增再降趨勢(shì)，細(xì)菌/真菌和G/G隨種植年限增加呈下降趨勢(shì)。根際土壤pH、速效磷、速效鉀、多酚氧化酶的變化是影響土壤微生物群落與組成的主要環(huán)境因子，真菌和G的增加及多酚氧化酶活性的降低可能是誘導(dǎo)花椒根腐病發(fā)生的重要原因。根據(jù)本文結(jié)果，建議對(duì)種植年限較長(zhǎng)的椒園采取適當(dāng)?shù)母鞴芾泶胧?，如調(diào)節(jié)土壤pH、均衡肥料配比與施用量等，將有利于改善椒園的土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，提高土壤質(zhì)量，以促進(jìn)高種植年限椒樹的健康生長(zhǎng)，為花椒的科學(xué)種植和病害防治產(chǎn)生積極作用。