不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥H2S產(chǎn)生和活性氧代謝的影響

劉建新 劉瑞瑞 劉秀麗 賈海燕 卜 婷 李 娜

（甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，慶陽 745000）

裸燕麥（L.）是禾本科（Poaceae）燕麥屬（）一年生糧草兼用型作物，其籽粒含15.6%蛋白質(zhì)和8.8%脂肪，且富含礦物質(zhì)、膳食纖維、黃酮和皂苷等成分，具有營養(yǎng)和降低血糖、血清膽固醇等保健功效。裸燕麥起源于中國，在植物分類上是燕麥屬一個獨(dú)立的栽培種。我國栽培裸燕麥已有2 500多年，主要分布在西北、華北和西南等地的高海拔冷涼地帶，年種植面積約55 萬hm。中國西北鹽漬化土壤廣泛分布，隨著氣候變暖和生產(chǎn)中長期偏施化肥，土壤鹽堿化程度日趨加劇，嚴(yán)重影響裸燕麥生長發(fā)育和產(chǎn)量提升。鹽堿脅迫下，植物礦質(zhì)離子失衡和光合作用受阻，活性氧（ROS）積累，生理代謝紊亂和生長受抑。

硫化氫（hydrogen sulfide，HS）是植物中發(fā)現(xiàn)的第3 種氣體信號，它參與植物多種生理過程，并在植物抵抗干旱、高溫、冷害和重金屬等逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。HS 能夠增強(qiáng)植物耐受鹽堿脅迫的能力，如NaCl 脅迫下，HS 通過提高大麥（）質(zhì)膜和液泡膜H-ATP酶轉(zhuǎn)錄和液泡Na/H逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及調(diào)控小麥（）非選擇性陽離子通道（NSCCs）和鹽超敏感（SOS1）通路維持Na、K穩(wěn)態(tài)。外源HS 通過上調(diào)抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）循環(huán)維持鹽脅迫下玉米（）體內(nèi)AsA 和GSH 氧化還原狀態(tài)；通過提高抗氧化水平降低鹽脅迫誘導(dǎo)的ROS 積累對茶樹（）細(xì)胞膜的氧化損傷；改善鹽堿脅迫對垂絲海棠（）光合功能的抑制；緩解鹽脅迫對番茄（）PS Ⅱ的傷害；提高鹽脅迫下小麥抗氧化防御系統(tǒng)活性。這些研究表明，外施HS 不僅可維持Na、K穩(wěn)態(tài)，還可通過調(diào)控ROS代謝增強(qiáng)植物對鹽堿脅迫的耐性。但這些研究多以單一NaCl脅迫下的植物幼苗為研究對象，缺乏根據(jù)作物種植地土壤鹽堿組成，在不同生育時期施用HS 對植物生理響應(yīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)的研究。本試驗(yàn)?zāi)M甘肅省中部裸燕麥種植地鹽堿含量和成分，采用盆栽土培試驗(yàn)探討裸燕麥不同生育時期噴施不同濃度HS 供體硫氫化鈉（NaHS）對內(nèi)源HS 產(chǎn)生和ROS 代謝的調(diào)控作用，旨在從抗氧化防御角度篩選最佳的HS 噴施時期和噴施濃度，為西北裸燕麥抗鹽堿栽培管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2020 年3 月至8 月在甘肅省隴東生物資源保護(hù)利用與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物科技園進(jìn)行。供試裸燕麥品種‘定莜號9’種子購自甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院；試驗(yàn)所用NaHS、NaCl、NaSO、NaCO和NaHCO購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。供試土壤采自黃土高原董志塬慶陽市（35°36′45″N，107°34′43″E），土壤類型黑壚土，質(zhì)地粉砂壤。取耕作層（0～20 cm）土風(fēng)干、打碎，過5 mm 篩。土壤基本理化性狀為pH 7.89，有機(jī)質(zhì)11.88 g·kg，全氮（N）0.785 g·kg，全磷（PO）0.601 g·kg，全鉀（KO）18.56 g·kg，堿解氮38.74 mg·kg，速效磷（PO）6.79 mg·kg，速效鉀（KO）176.8 mg·kg，土壤電導(dǎo)率（EC）3.3 mS·cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用噴施時期和NaHS 濃度雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。噴施時期設(shè)幼苗期、拔節(jié)期、抽穗期、開花期、灌漿期5 個水平；NaHS 濃度設(shè)0、25、50、100、200、400 μmol·L6 個水平，共30 個處理。試驗(yàn)用塑料盆口徑為31.5 cm，底徑25.0 cm，高34.0 cm，配有底托以便滲水返回盆中。模擬甘肅省中部裸燕麥主栽區(qū)土壤含鹽量和鹽堿組成，按土壤含鹽量3.00 g·kg，按摩爾比（NaCl）∶（NaSO）∶（NaCO）∶（NaHCO）=12∶8∶1∶9 復(fù)配混合，與18.0 kg 風(fēng)干土（含水量2.02%）混勻，再拌入4 L 有機(jī)草碳基質(zhì)（有機(jī)質(zhì)≥45%，育鑫豐基質(zhì)有限公司）、復(fù)合肥（N-PO-KO=13-17-15，山東聯(lián)盟磷肥有限公司）0.50 g·kg和微生物菌肥（山東土秀才生物科技有限公司，有效活菌數(shù)≥10 億·g）14.1 g·kg后 裝 盆，按 田 間 持 水 量75%澆水平衡和沉實(shí)3 d 后播種裸燕麥（2020 年3月26 日），每盆播70 粒種子（0.2%多菌靈拌種12 h），播后覆土3 cm。4 月22 日間苗和疏苗，5 月4日每盆定苗25 株。整個生育期葉面追施2 次0.2% KHPO（5 月28 日和6 月14 日），常規(guī)管理。分別在裸燕麥幼苗期（5 月24 日）、拔節(jié)期（6 月9日）、抽穗期（6 月14 日）、開花期（6 月25 日）、灌漿期（6 月30 日）葉面噴施0、25、50、100、200、400 μmol·LNaHS。每盆為1 個重復(fù)，重復(fù)5 次，隨機(jī)排列。早晚各噴施1 次，連噴3 d，噴施量每盆40 mL，噴施液含0.01%吐溫?80 以提高葉面黏附性。各時期最后1 次噴施后第72 h 剪取倒2 葉用液氮速凍超低溫冰箱?70 ℃保存，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 HS 含量和-半胱氨酸脫巰基酶（LCD）活性測定

HS含量測定參考高曉蘭等方法進(jìn)行修改：取1.0 g 葉片，加入3.0 mL 預(yù)冷的100 mmol·L磷酸鉀緩沖液（pH7.4，內(nèi)含10 mmol·LEDTA 和0.25%醋酸鋅）和少許石英砂，研磨，再用2.0 mL磷酸鉀緩沖液轉(zhuǎn)移勻漿至離心管，離心15 min（4 ℃，12 000×），取上清液2.4 mL，加入0.3 mL 5 mmol·LN，N-二甲基對苯二胺，搖勻，加入0.3 mL 50 mmol·LFeCl搖勻15 min，在667 nm 下測定吸光度。以NaS 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算HS 含量。LCD 活性按Chen等的方法測定。

按陳建勛等的方法測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性；谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定參照FOSTER 等的方法。AsA 含量測定用二聯(lián)吡啶比色法；GSH 含量測定用二硫二硝基苯甲酸法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以單位鮮質(zhì)量材料為基礎(chǔ)計(jì)算結(jié)果，用Micorsoft Excel 2007 整理；采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析和Duncan 法多重比較（顯著性水平0.05），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。為綜合反映不同時期噴施NaHS的效應(yīng)，參考劉建新等方法計(jì)算不同處理的隸屬函數(shù)綜合評價值（）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片H2S含量的影響

從表1 可見，與噴施0 μmol?LNaHS 相比，在幼苗期噴施50、100、200 μmol?LNaHS 的裸燕麥葉片HS 含量顯著提高，噴施25 和400 μmol?LNaHS 的HS 含量差異不顯著；拔節(jié)期噴施100、200、400 μmol?LNaHS 顯著提高HS 含量，噴施25、50 μmol?LNaHS的HS含量與噴施0 μmol?LNaHS 的差異不顯著；抽穗期噴施不同濃度NaHS不 同 程 度 提 高 了HS 含 量，其 中50、100、400 μmol?LNaHS 處理的HS 含量差異顯著；開花期噴施不同濃度NaHS 的HS 含量不同程度降低，除200 μmol?LNaHS 處理的HS 含量差異不顯著外，其余濃度NaHS 處理的HS 含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；灌漿期噴施不同濃度NaHS 顯著提高了HS含量，其中噴施100 μmol?LNaHS 的HS含量最大，提高了95.4%。

表1 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片H2S含量的影響Table 1 Effects of spraying NaHS in different periods on H2S content of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.2 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片LCD活性的影響

LCD 是植物體內(nèi)催化-半胱氨酸脫巰基產(chǎn)生HS 的關(guān)鍵酶。表2 顯示，與噴施0 μmol?LNaHS 相比，幼苗期噴施25～400 μmol?LNaHS 后裸燕麥葉片LCD 活性呈先升后降趨勢，50、100、200 μmol?LNaHS 處理顯著提高了LCD 活性；拔節(jié)期的LCD 活性隨NaHS 噴施濃度提高亦呈駝峰變化，其中100 μmol?LNaHS 處理的LCD 活性最大；抽穗期的LCD 活性隨NaHS濃度提高呈升—降—升變化，100 μmol?LNaHS 處理下LCD 活性最大；開花期噴施NaHS降低了LCD活性，在NaHS噴施濃度為25～400 μmol?L范圍內(nèi)LCD活性呈先升后降變化，其中200 μmol?LNaHS 處理的LCD 活性最高；灌漿期LCD 活性隨NaHS噴施濃度增大呈雙峰曲線變化，其中噴施100 μmol?LNaHS 的LCD 活性最高，噴施25 μmol?LNaHS 的LCD 活性次之。

表2 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片LCD活性的影響Table 2 Effects of spraying NaHS in different periods on LCD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.3 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片?.O2 、H2O2和MDA含量的影響

2.4 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片SOD、CAT、POD和APX活性的影響

表6～9 表明，與噴施0 μmol?LNaHS 相比，幼苗期噴施50 μmol?LNaHS 顯著降低了SOD 活性；25 μmol?LNaHS 處理提高了CAT 和POD 活性，50、200 和400 μmol?LNaHS 處理顯著降低了CAT 活性，100、200 和400 μmol?LNaHS 處理顯著降低了POD 活性，400 μmol?LNaHS 處理顯著提高了APX 活性。拔節(jié)期噴施25 μmol?LNaHS降低了SOD 活性，噴施400 μmol?LNaHS 提高了SOD 活性；但噴施25～400 μmol?LNaHS 的CAT活性與噴施0 μmol?LNaHS 的差異不大，噴施100 μmol?LNaHS 的POD 活性顯著升高；噴施50～400 μmol?LNaHS 的APX 活性顯著下降。抽穗期噴施50 μmol?LNaHS的SOD活性降低，CAT活性提高，噴施200 μmol?LNaHS 的CAT 活性下降；噴施25～400 μmol?LNaHS 的POD 和APX 活性變化不大。開花期噴施25 μmol?LNaHS 顯著降低了SOD 活性；噴施25～400 μmol?LNaHS 未顯著改變CAT 和POD 活性，顯著提高了APX 活性。灌漿期噴施25、50、200 μmol?LNaHS的SOD活性顯著低于噴施0 μmol?LNaHS；但25～400 μmol?LNaHS 處理的CAT 和POD 活性沒有發(fā)生顯著改變，50、100 μmol?LNaHS處理顯著提高了APX活性。

表3 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片O?2. 含量的影響Table 3 Effects of spraying NaHS in different periods on O?2. content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表4 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片H2O2含量的影響Table 4 Effects of spraying NaHS in different periods on H2O2content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表5 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片MDA含量的影響Table 5 Effects of spraying NaHS in different periods on MDA content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表6 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片SOD活性的影響Table 6 Effects of spraying NaHS in different periods on SOD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表7 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片CAT活性的影響Table 7 Effects of spraying NaHS in different periods on CAT activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表8 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片POD活性的影響Table 8 Effects of spraying NaHS in different periods on POD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表9 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片APX活性的影響Table 9 Effects of spraying NaHS in different periods on POD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.5 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片AsA、GSH含量和GR活性的影響

AsA 和GSH 兩種抗氧化物質(zhì)可直接或通過AsA-GSH 循環(huán)清除ROS，而GR 在維持AsA、GSH氧化還原平衡中起關(guān)鍵作用。表10～12 表明，與噴施0 μmol?LNaHS 相比，幼苗期噴施50、100 μmol?LNaHS 顯著降低了AsA 含量，卻不同程度提高了GSH含量，噴施25、200、400 μmol?LNaHS的GR活性顯著提高。拔節(jié)期噴施50 μmol?LNaHS提高了AsA 含量，噴施25～400 μmol?LNaHS 沒有改變GSH 含量和GR 活性。抽穗期噴施25～400 μmol?LNaHS 均可不同程度提高AsA 含量；但沒有顯著影響GR 活性；噴施25 μmol?LNaHS 降低了GSH 含量，噴施400 μmol?LNaHS 提高了GSH含量。開花期噴施25 μmol?LNaHS 顯著降低了AsA含量；噴施50～400 μmol?LNaHS不同程度提高了GSH 含量和GR 活性。灌漿期噴施25～400 μmol ?LNaHS 的AsA 含 量 與 噴 施0 μmol ?LNaHS 無顯著差異；但100 和400 μmol?LNaHS處理的GSH 含量顯著下降；噴施100 μmol?LNaHS的GR 活性顯著提高。其他濃度NaHS 處理的AsA、GSH 含量和GR 活性與0 μmol?LNaHS 處理的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表10 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片AsA含量的影響Table 10 Effects of spraying NaHS in different periods on AsA content of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.6 噴施時期和NaHS濃度對裸燕麥H2S產(chǎn)生和ROS代謝的雙因素方差分析

2.7 不同時期噴施NaHS 對鹽堿脅迫下裸燕麥H2S產(chǎn)生和ROS代謝的隸屬函數(shù)綜合評價

從圖1 可知，噴施時期和NaHS 濃度對裸燕麥上述指標(biāo)的值有顯著影響。在幼苗期噴施200和25 μmol?LNaHS可顯著提高值；拔節(jié)期噴施200 μmol?LNaHS 的值顯著升高；抽穗期噴施25～400 μmol?LNaHS 的值與噴施0 μmol?LNaHS 的值無顯著差異；開花期噴施50、100、200 μmol?LNaHS 顯著提高值，其中50 μmol?LNaHS 的值最大，噴施400 μmol?LNaHS 的值差異不顯著；灌漿期噴施50、100 μmol?LNaHS的值顯著提高，噴施25、200、400 μmol?LNaHS的值與0 μmol?LNaHS處理無顯著差異。

圖1 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥隸屬函數(shù)綜合評價值（D）的影響不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）Fig.1 Effects of spraying NaHS in different periods on comprehensive evaluation value of membership function（D）for naked oat under saline-alkali stress Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level

表11 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片GSH含量的影響Table 11 Effects of spraying NaHS in different periods on GSH content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表12 不同時期噴施NaHS對鹽堿脅迫下裸燕麥葉片GR活性的影響Table 12 Effects of spraying NaHS in different periods on GR activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表13 NaHS噴施濃度和噴施時期對裸燕麥H2S產(chǎn)生和活性氧代謝的雙因素方差分析結(jié)果Table 13 Two-way analysis of variance for spraying periods and NaHS concentrations on H2S production and active ox‐ygen metabolism of naked oat

3 討論

HS在植物體內(nèi)具有多種生成途徑，以-半胱氨酸為底物由LCD 催化的HS 產(chǎn)生是其主要的合成途徑。HS 作為氣體信號可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞與相應(yīng)靶分子結(jié)合，快速高效參與調(diào)控植物生長發(fā)育等生理過程以及緩解干旱、鹽害、高溫、冷害和重金屬等逆境帶來的氧化損傷。周超凡等指出，外源NaHS 促進(jìn)黃瓜（）受低溫脅迫誘導(dǎo)的LCD催化HS的合成，并通過增強(qiáng)活性氧清除能力減輕低溫引起的光合機(jī)構(gòu)損傷。吳延朋等研究表明，鹽脅迫下擬南芥（）體內(nèi)HS合成相關(guān)酶L/D-CD 活性及HS含量顯著升高。本研究結(jié)果顯示：在鹽堿混合脅迫下，不同時期噴施NaHS 可引起裸燕麥葉片中HS含量和LCD活性發(fā)生顯著改變（見表1～2）；幼苗期以噴施50 μmol?LNaHS的HS含量和LCD活性最高；拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期以噴施100 μmol?LNaHS 的HS 含量和LCD 活性最大；開花期噴施25～400 μmol?LNaHS使HS 含量和LCD 活性不同程度下降。說明一定時期噴施適宜濃度NaHS 可誘導(dǎo)鹽堿脅迫下裸燕麥體內(nèi)由LCD 催化的HS 生成。這與高曉蘭等的外施NaHS可誘導(dǎo)桃（）實(shí)生苗體內(nèi)HS合成的結(jié)果類似。因此，在裸燕麥幼苗—抽穗期和灌漿期噴施50～100 μmol?LNaHS 能夠有效提高體內(nèi)HS含量。

外源HS對鹽堿脅迫下裸燕麥內(nèi)源HS的產(chǎn)生和ROS 代謝的影響隨NaHS 施用時期和噴施濃度而發(fā)生變化，是ROS清除系統(tǒng)成員分工協(xié)同相互作用的結(jié)果，通過隸屬函數(shù)分析可綜合反映ROS代謝對外源HS 的響應(yīng)。本試驗(yàn)以12 個HS 生成和ROS代謝相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)分析表明：噴施時期和NaHS濃度及二者的交互作用對D值存在顯著影響；Duncan 法測驗(yàn)顯示，在幼苗期噴施25、200 μmol?LNaHS及拔節(jié)期噴施200 μmol?LNaHS 的D值顯著高于其它時期噴施其他濃度NaHS的D值（見圖1）。可見，從ROS代謝的角度來考察，以裸燕麥幼苗期和拔節(jié)期噴施25～200 μmol?LNaHS 更能有效促進(jìn)內(nèi)源HS生成和維持ROS代謝平衡。

4 結(jié)論

致謝 感謝2017級生物技術(shù)班王婷、劉秀龍、景鼎鼎和王劍同學(xué)在指標(biāo)檢測和數(shù)據(jù)分析中所做的大量工作。