松屬針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征在分類學中的應用

李 俊 段雅萍 蔡秀珍* 王 婷 潘柏含

（1. 湖南師范大學生命科學學院，長沙 410081；2. 湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208）

現(xiàn)存裸子植物中，松科（Pinaceae）為種類最多、分布最廣、占據(jù)森林面積和木材蓄積量最大的類群，其特有性較高，且各特有屬、種的分布區(qū)型常常代表它們所占據(jù)的各級區(qū)系區(qū)。松樹是松屬（）植物的泛稱，為松科中最大的世界性大屬，廣泛分布于北半球，全球約有110種，幾乎占松科種數(shù)的50%；我國產(chǎn)22種10變種，分布幾遍全國；另引入16種。

松屬植物最明顯的特征是葉成針狀，常2針、3針或5 針一束，每束針葉基部被葉鞘包圍，葉內(nèi)具1～2個維管束和多個樹脂道。針葉呈旱生形態(tài)，表皮外壁覆蓋有發(fā)達的非細胞結(jié)構(gòu)的角質(zhì)層。角質(zhì)層與表皮細胞緊密結(jié)合，植物表皮細胞的形態(tài)、排列方式，以及氣孔器的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分布、排列方式、開口方向等形態(tài)特征均能在角質(zhì)層上反映出來。和被子植物相比，裸子植物葉的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，不易受環(huán)境變化的影響。在松柏類植物中，葉的外部形態(tài)比生殖結(jié)構(gòu)更為一致，它們?nèi)~的結(jié)構(gòu)特征具有一定的分類學價值。因此，比較研究松屬植物針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征，可為該屬的分類研究提供新證據(jù)。

植物角質(zhì)層形態(tài)特征在分類學上的應用，最早始于英國。迄今為止，國內(nèi)外學者已對羅漢松科（Podocarpaceae）、松科、柏科（Cupressaceae）、紅豆杉科（Taxaceae）、蘇鐵科（Cycadaceae）和殼斗科（Fagaceae）等植物類群，特別是羅漢松科進行了大量研究。國內(nèi)有關(guān)松屬針葉角質(zhì)層特征的研究，僅見于早期胡玉熹利用掃描電鏡觀察了松屬部分種類針葉角質(zhì)層的內(nèi)表面結(jié)構(gòu)，但其研究并未詳細描述各供試材料的角質(zhì)層特點和角質(zhì)層外表面結(jié)構(gòu)特征。松屬是植物分類學上公認的困難類群，應用傳統(tǒng)形態(tài)學特征對該屬進行分類、鑒別，面臨著一些困難和挑戰(zhàn)；其屬下分類，尤其是組級水平上的分類長期存在爭議；白皮松的分類地位問題也有待進一步探討。

因此，本文選取涵蓋單維管束松亞屬（Sub?genus）和雙維管束松亞屬（Subgenus）共12 種松屬植物為供試材料，利用光學顯微鏡和掃描電鏡，對松針角質(zhì)層內(nèi)、外表面的微形態(tài)特征進行了細致觀察，旨在為松屬屬下分類、種間鑒定，以及屬下種類系統(tǒng)地位的確定提供新證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為海南五針松（）等12 種松屬植物（見表1），采于河南省和湖南省等地，憑證標本存放于湖南師范大學植物標本館（HNNU）。

表1 材料來源和憑證標本Table 1 The origin of materials and vouchers

1.2 方法

野外采集生長良好的新鮮枝條，立即將其置于FAA固定液中浸泡、備用。

制備角質(zhì)層：參照馬清溫實驗方法，從FAA固定液中選取完整成熟的針葉，取中間部分切成小長條。用30%的過氧化氫（HO）和100%冰醋酸（CHO）處理，水浴鍋中60 ℃加熱12 h；當角質(zhì)層與內(nèi)部組織自然分離時，取出角質(zhì)層，清除殘存在角質(zhì)層內(nèi)表面的細胞；用蒸餾水沖洗數(shù)次。

光學顯微鏡觀察：松針角質(zhì)層經(jīng)酚紅染色后，制成臨時裝片，Olympus BX51 數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)和Motic BA210-T 型光學顯微鏡下，用不同倍數(shù)物鏡觀察角質(zhì)層形態(tài)結(jié)構(gòu)并照相。

掃描電鏡觀察：松針角質(zhì)層樣品經(jīng)各級酒精脫水干燥，每梯度間隔30 min。干燥后，用叔丁醇置換2 h 以上。將每個樣品角質(zhì)層的葉近軸面（內(nèi)表面）和遠軸面（外表面）朝上，用導電膠粘貼于銅質(zhì)樣品臺上。經(jīng)JFC-1600型離子濺射儀噴金鍍膜后，JSM-IT500型掃描電鏡下觀察、照相。

本文所用術(shù)語主要參照孫同興和Whang等的報道。

2 研究結(jié)果

2.1 松屬針葉角質(zhì)層內(nèi)表面形態(tài)特征

在光學顯微鏡和掃描電鏡下，松屬12 種植物針葉角質(zhì)層內(nèi)表面特征，在細胞大小、形狀和紋飾等方面在不同亞屬和組中差異較明顯。角質(zhì)層內(nèi)表面形態(tài)特征觀察到的12 個性狀，可被劃分為與表皮細胞、氣孔和表皮毛有關(guān)的3 大類型（觀察結(jié)果見表2，圖版：Ⅰ～Ⅱ）。

表2 12種松屬針葉角質(zhì)層內(nèi)表面形態(tài)特征Table 2 Some internal cuticular characteristics of leaves of 12 Pinus species

與表皮細胞有關(guān)的性狀共涉及6 個：（1）表皮細胞長度；（2）表皮細胞端壁形狀；（3）光學顯微鏡下表皮細胞垂周壁紋路；（4）掃描電鏡觀察下表皮細胞垂周壁紋路；（5）靠近表皮毛的表皮細胞形態(tài)；（6）表皮細胞形狀。除白皮松表皮細胞長度相對較短外，其余11 種松屬植物的表皮細胞均較長。白皮松的表皮細胞平均長度約為100 μm（圖版Ⅰ：1），日本五針松、馬尾松、黑松、黃山松和濕地松大部分為200～300 μm（圖版Ⅰ：9～18），海南五針松、華南五針松、華山松、火炬松和萌芽松大部分為300～400 μm（圖版Ⅰ：3～8，19～22），而長葉松則長達500 μm 以上（圖版Ⅰ：23～24）。表皮細胞端壁有3 種形態(tài)，以垂直端壁最為常見，較少為傾斜端壁，極少數(shù)為錐形端壁。這些端壁形狀常共存于一個物種內(nèi)，所有供試材料均具以上3 種形態(tài)端壁，但錐形端壁出現(xiàn)頻率較低（圖版Ⅰ：1～24）。光學顯微鏡下，白皮松、海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松表皮細胞垂周壁呈鋸齒狀或深波狀（圖版Ⅰ：1～10），馬尾松、黑松、黃山松、濕地松、火炬松、萌芽松和長葉松呈淺波狀（圖版Ⅰ：11～24）。掃描電鏡下，白皮松、海南五針松和華山松表皮細胞垂周壁呈波狀（圖版Ⅱ：1，7），華南五針松和日本五針松呈鋸齒狀或波狀（圖版Ⅱ：5，9），馬尾松和濕地松不明顯（圖版Ⅱ：11，17），黑松、黃山松和萌芽松呈直線狀（圖版Ⅱ：13，15，19），火炬松和長葉松則呈凸出條紋狀（圖版Ⅱ：19，23）。12 種松屬植物的表皮細胞形狀由直到彎，由彎到蜿蜒（圖版Ⅰ：1～24）。一些靠近表皮毛的表皮細胞形態(tài)大小與其他表皮細胞不盡相同：白皮松、華南五針松、馬尾松、黑松、黃山松、濕地松、火炬松和長葉松的表皮細胞有變短趨勢（圖版Ⅰ：1，5，11，13～15，17，19，23）；萌芽松有變窄趨勢（圖版Ⅰ：21）。

圖版Ⅱ 掃描電鏡下松針角質(zhì)層內(nèi)表面1～2.白皮松；3～4.海南五針松；5～6.華南五針松；7～8.華山松；9～10.日本五針松；11～12.馬尾松；13～14.黑松；15～16.黃山松；17～18.濕地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.長葉松Plate Ⅱ Scanning electron micrographs of the inner surface of the cuticles 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

圖版Ⅰ 光學顯微鏡下的松針角質(zhì)層1～2.白皮松；3～4.海南五針松；5～6.華南五針松；7～8.華山松；9～10.日本五針松；11～12.馬尾松；13～14.黑松；15～16.黃山松；17～18.濕地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.長葉松PlateⅠ The cuticles of pine needle under light microscope 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

與氣孔有關(guān)的性狀共有4 個：①保衛(wèi)細胞形狀；②副衛(wèi)細胞痕跡；③氣孔帶的連續(xù)性；④氣孔帶之間表皮細胞。氣孔器大部分為橢圓形，白皮松氣孔器呈短橢圓形（圖版Ⅱ：2），海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松氣孔器呈橢圓形，副衛(wèi)細胞痕跡不明顯（圖版Ⅱ：3～6，8，10）；馬尾松、黑松、黃山松、火炬松和萌芽松氣孔器呈橢圓形，可見副衛(wèi)細胞痕跡（圖版Ⅱ：11～16，19～22）；濕地松和長葉松氣孔器為長橢圓形，可見副衛(wèi)細胞痕跡（圖版Ⅱ：18，24）。大部分供試材料氣孔排列均是連續(xù)的，僅華南五針松和日本五針松的氣孔排列有小部分間斷（圖版Ⅰ：5，9）。氣孔帶之間的表皮細胞行數(shù)變化很大（0～20 行）。華南五針松、華山松、日本五針松、海南五針松和白皮松氣孔帶之間的表皮細胞行數(shù)個別有為0（圖版Ⅰ：1，3，5，7，9），其余種類氣孔行之間的表皮細胞行數(shù)均大于或等于3行（圖版Ⅰ：11～13，15～24）。

與表皮毛有關(guān)的性狀有2個：①靠近表皮毛的凹槽；②表皮毛長度。本研究中12 種松屬植物靠近表皮毛的表皮細胞均易脫落，導致出現(xiàn)凹槽。白皮松、馬尾松、黑松、黃山松、濕地松和長葉松在角質(zhì)層內(nèi)表面，靠近表皮毛的地方具有一條發(fā)達的凹槽（圖版Ⅱ：1，11，13，15，17，23），其余種類雖具凹槽但不甚明顯，其中海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松的凹槽形狀相似（圖版Ⅱ：3，5，7，9），火炬松和萌芽松的凹槽形狀相似（圖版Ⅱ：19，21）。在光學顯微鏡下，可清楚觀察到一個表皮毛的長度，發(fā)現(xiàn)海南五針松、華南五針松和華山松的表皮毛長度為300～600 μm（圖版Ⅰ：3，5，7），白皮松、馬尾松、黑松、黃山松、濕地松、火炬松和萌芽松的表皮毛長度為200～400 μm（圖版Ⅰ：1，11，13，15，17，19，21），而長葉松的表皮毛長度為400～600 μm（圖版Ⅰ：24）。

2.2 松屬針葉角質(zhì)層外表面形態(tài)特征

松屬針葉角質(zhì)層外表面形態(tài)特征共觀察到8個性狀，可分為與表面形態(tài)氣孔有關(guān)2 大類型，詳見表3及圖版Ⅲ。

圖版Ⅲ 掃描電鏡下松針角質(zhì)層外表面1～2.白皮松；3～4.海南五針松；5～6.華南五針松；7～8.華山松；9～10.日本五針松；11～12.馬尾松；13～14.黑松；15～16.黃山松；17～18.濕地松；19～20.火炬松；21～22.萌芽松；23～24.長葉松Plate Ⅲ Scanning electron micrographs of the outer surface of the cuticles 1～2.Pinus bungeana；3～4.P.fenzeliana；5～6.P.kwangtungensis；7～8.P.armandii；9～10.P.parviflora；11～12.P.massoniana；13～14.P.thunbergii；15～16.P.taiwanensis；17～18.P.elliottii；19～20.P.taeda；21～22.P.echinata；23～24.P.palustris

表3 12種松屬針葉角質(zhì)層外表面特征Table 3 Some external cuticular characteristics of leaves of 12 Pinus species

與表面形態(tài)有關(guān)的角質(zhì)層外表面特征涉及3個性狀，即表面起伏、表皮細胞輪廓和表皮毛。12種松屬植物針葉外表面紋理有起伏，表皮細胞輪廓可見。其中，海南五針松、華南五針松、日本五針松和華山松的表面起伏和細胞輪廓尤其明顯（圖版Ⅲ：3～10），白皮松、馬尾松和萌芽松表面起伏和細胞輪廓較明顯（圖版Ⅲ：1，11～21），而黑松、黃山松、濕地松、火炬松和長葉松表面則僅有微起伏、僅能辨別出表皮細胞存在（圖版Ⅲ：13，15，17，19）。除日本五針松針葉表皮毛不太明顯外（圖版Ⅲ：9），其余11種松屬植物針葉均明顯可見表皮毛（圖版Ⅲ：1，3，5，7，11，13，15，17，19，21，23）。

與氣孔有關(guān)的角質(zhì)層外表面特征共涉及5 個性狀：①伏羅林環(huán)（Florin ring）；②溝槽；③針絮狀物質(zhì)；④氣孔塞；⑤氣孔形狀。所有供試材料均具伏羅林環(huán)，尤其是白皮松、海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松的伏羅林環(huán)特別顯著（圖版Ⅲ：1～10），而馬尾松和黃山松則不太明顯（圖版Ⅲ：11～12，15～16）。伏羅林環(huán)基外側(cè)溝槽在一些松屬種類中并不存在，如馬尾松、黑松和黃山松等（圖版Ⅲ：11～16）；在白皮松、海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松中有微弱發(fā)育（圖版Ⅲ：1～10）。有些種類氣孔會出現(xiàn)氣孔塞，如馬尾松、黑松和黃山松氣孔有一部分有氣孔塞（圖版Ⅲ：11～15），而白皮松、火炬松和萌芽松氣孔大部分都有氣孔塞（圖版Ⅲ：1，19～22），其余種類則未觀察到氣孔塞。有些種類氣孔旁邊具針絮狀物質(zhì)，其中華山松氣孔旁較多（圖版Ⅲ：8），海南五針松和華南五針松氣孔旁較少（圖版Ⅲ：4，6），其余種類則沒有。外部氣孔形狀共有5種形態(tài)：橢圓形（圖版Ⅲ：2）、矩形（圖版Ⅲ：20）、多邊形（圖版Ⅲ：24）、鞋形（圖版Ⅲ：8）和圓形（圖版Ⅲ：22）。

3 討論

3.1 松屬針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征在組水平上的分類價值

《中國植物志》將本研究中12種松屬植物歸入單維管束松亞屬和雙維管束松亞屬2個亞屬，單維管束松亞屬下的五針松組（Section）含海南五針松、華南五針松、華山松和日本五針松4種，白皮松組（Section）含白皮松1 種，雙維管束松亞屬下的油松組（Section）含馬尾松、黑松、黃山松、濕地松、火炬松、萌芽松和長葉松7 種；而在《A Handbook of the World’s Coni?fers》中，該12種歸入與《中國植物志》相同的2個松屬亞屬，但在組分類上與《中國植物志》有所不同，其分為Section、Section和Section3 組，把五針松組和白皮松組合并為Section，油松組分為Sec?tion（馬尾松、黑松和黃山松）和Section（濕地松、火炬松、萌芽松和長葉松）2 個組。本研究參考馬清溫等實驗方法，使用過氧化氫和冰醋酸，代替Whang 和Kim 等所使用的三氧化二鉻，使得角質(zhì)層內(nèi)表面有些地方仍有一層表皮細胞和氣孔復合體，從而可以觀察到一些新的特征，如靠近表皮毛表皮細胞形態(tài)和表皮毛長度等。這些新的特征，亦可為松屬在組級水平上的分類提供一些新依據(jù)。本研究觀察到白皮松表皮細胞和表皮毛長度比五針松組的長度明顯要短；五針松組角質(zhì)層外表面的起伏程度和表皮細胞輪廓均比白皮松明顯；白皮松角質(zhì)層外表面氣孔有氣孔塞但無針絮狀物質(zhì)，五針松組氣孔大部分有針絮狀物質(zhì)但無氣孔塞；白皮松角質(zhì)層外表面氣孔均為橢圓形，五針松組氣孔至少有2種不同的形態(tài)。以上針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征在五針松組和白皮松組之間區(qū)別明顯，筆者認為將五針松組和白皮松組合并為Section是不太合適的。此外，針葉角質(zhì)層微形態(tài)所表現(xiàn)的20 個性狀均不支持將油松組分成Section和Section2 個組。松屬植物針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征具有自身的特異性，可作為屬下組級分類的重要依據(jù)。

3.2 白皮松的分類學地位問題

蔣輝、李湘萍、陸素娟和宋湛謙等學者認為白皮松組應從單維管束松亞屬中獨立成白皮松亞屬（Subgenus）。在外部形態(tài)如樹皮和針葉、針葉解剖學如氣孔、木材解剖如射線管胞內(nèi)壁和管胞疣狀層、孢粉研究如本體與氣囊交界處的夾角、木材中化學物質(zhì)如多酚物質(zhì)等、種子油成分如脂肪酸、松脂的成分如樹脂酸、細胞學中核型分析、基因中單親遺傳葉綠體DNA等研究中，均表明白皮松確實為松屬各種中一個較為特殊的種類，兼有松屬2 個亞屬的特征或具獨特的特征，系一個中間型樹種，白皮松的分類學地位問題值得探討。

本研究結(jié)果表明，白皮松的針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征在12 種松屬中顯得尤其特殊，其部分特征與五針松組的特征相同，如：角質(zhì)層內(nèi)表面光學顯微鏡和掃描電鏡觀察下的垂周壁紋路、無副衛(wèi)細胞痕跡和表皮毛下凹槽形態(tài)，角質(zhì)層外表面伏羅林環(huán)的發(fā)育和氣孔的溝槽；部分特征與油松組的特征相似，如：角質(zhì)層內(nèi)表面靠近表皮毛的表皮細胞形態(tài)和表皮毛的長度，角質(zhì)層外表面氣孔旁無針絮狀物質(zhì)和有氣孔塞等特征則更加接近油松組；部分特征又不同于其他松屬，如表皮細胞長度、角質(zhì)層外表面起伏和表皮細胞輪廓（除馬尾松和萌芽松）和氣孔形狀。以上特征均體現(xiàn)白皮松在針葉角質(zhì)層微形態(tài)方面的獨特性，可為白皮松亞屬的建立提供新的論據(jù)。

3.3 火炬松和濕地松的種間鑒定

在油松組中，火炬松和濕地松形態(tài)極其相似，其樹皮均為褐色、鱗片狀開裂；枝條均每年生長數(shù)輪，小枝為褐色；冬芽圓柱形；針葉均具2～3 針一束并存的現(xiàn)象；球果均圓錐形或窄圓錐形，且有時火炬松和濕地松形成混交林，二者難于鑒別區(qū)分。物種形態(tài)鑒定之難，在于種間的差異較小，或者由于種間分布區(qū)重疊，種間發(fā)生著不同程度的基因漸滲雜交，從而使得種間的分類界限模糊，分類鑒定困難；同時有些樹種分布范圍廣，種內(nèi)常因種源、立地條件、不同年份氣象因子而產(chǎn)生更大的差異，這也使得一些種或變異類型的分類學地位長時間處于混亂狀態(tài)。在掃描電鏡下，濕地松針葉角質(zhì)層內(nèi)表面的表皮細胞垂周壁紋路不明顯，有部分表皮細胞脫落痕跡，火炬松的表皮細胞垂周壁紋路則呈凸出直線條紋狀；在針葉角質(zhì)層外表面，濕地松氣孔無氣孔塞，火炬松氣孔則大部分具氣孔塞；濕地松的氣孔形狀為圓形或橢圓形，火炬松的氣孔形狀為圓形或矩形。這些針葉角質(zhì)層微形態(tài)特征可為火炬松和濕地松提供種間界定依據(jù)。