運黑14207硒賦存形態(tài)及抗氧化特性研究

于章龍，趙智勇，劉 瑞，宋 昱，謝颯英，蔡 岳，孫元琳

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所/省部共建有機旱作農(nóng)業(yè)國家重點試驗室(籌)，山西運城 044000；2.運城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運城 044000)

黑小麥指籽粒顏色為黑、紫等色的小麥品種，屬于優(yōu)質(zhì)特色谷物資源。與普通小麥相比，黑小麥含有更加豐富的膳食纖維、酚酸、花色苷、B 族維生素和硒、鋅、鐵等微量元素以及多種活性物質(zhì)，以其特殊的營養(yǎng)價值而備受關(guān)注。研究表明，黑小麥籽粒硒含量高達0.2 mg·kg左右，屬于富硒谷物。硒是生物體必需的微量元素，也是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，它可以緩解機體因為自由基引起的氧化性損傷，對機體的生長發(fā)育、免疫機能和抗氧化性有重要作用。硒在植物體內(nèi)以無機硒和有機硒形態(tài)存在，有機硒在植物體內(nèi)存在的形式主要有硒蛋白、硒多糖和硒核酸等，較無機硒更易被人體吸收。探討富硒黑小麥硒的存在形態(tài)、各組分含量、抗氧化能力及其之間的關(guān)系，能夠為充分開發(fā)和利用富硒黑小麥提供理論基礎(chǔ)。本研究以運黑14207為原料，在分離提取蛋白質(zhì)、多糖和核糖組分的基礎(chǔ)上，利用原子熒光光度法檢測各組分中的硒含量，并分析各組分清除自由基的能力，以確定運黑14207中有機硒的主要賦存形態(tài)及其抗氧化活性，為其功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試黑小麥品種運黑14207，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所選育并提供。

1.2 方 法

1.2.1 原料預(yù)處理

參考李娟等的方法并稍作修改。用自來水將運黑14207籽粒洗凈，用去離子水沖洗，50～55 ℃烘干麥粒表面水分，用3100型波通小麥粉碎儀磨粉制備全麥粉。

稱取小麥粉100 g于燒杯中，加入200 mL丙酮脫脂，磁力攪拌2 h后抽濾，重復(fù)3次；將脫脂全麥粉置于干燥器內(nèi)備用。

1.2.2 硒含量測定

籽粒硒含量及各組分中硒含量測定均參照GB 5009.93-2010熒光法。

1.2.3 不同蛋白組分提取

參考趙萍等方法，采用累進提取法提取水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白；參考李甜等方法提取堿溶性蛋白；并稍作修改。

水溶性蛋白提取:準(zhǔn)確稱取脫脂全麥粉10.0 g于燒杯中，加入去離子水200 mL攪拌均勻；55 ℃超聲提取80 min，4 ℃、4 000 r·min離心20 min，取上清液并用去離子水定容至200 mL；向上清液中加入(NH)SO(62.6 g)，4 ℃冰箱中靜置24 h；低溫4 000 r·min離心30 min，棄上清液，用少量去離子水溶解沉淀并轉(zhuǎn)移至透析袋中，密封置于去離子水中，在4 ℃冰箱中靜置24 h，期間每隔3 h換一次去離子水。用10%的BaCl檢驗透析袋外側(cè)去離子水，直至無沉淀出現(xiàn)；利用Scientz-18ND寧波新芝生物真空冷凍干燥機冷凍干燥，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

鹽溶性蛋白提取:向經(jīng)提取水溶性蛋白后殘渣加入0.5 mol·LNaCl溶液150 mL，攪拌均勻；20 ℃超聲提取80 min，4 ℃、4 000 r·min離心20 min，收集上清液；用乙酸調(diào)節(jié)pH=4.5，4 ℃冰箱中靜置24 h；4 ℃、4 000 r·min離心30 min，將沉淀用少量0.5 mol·LNaCl溶液溶解，真空冷凍干燥，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

醇溶性蛋白提取:向提取鹽溶性蛋白后殘渣加入75%乙醇溶液 250 mL，攪拌均勻。20 ℃條件下超聲提取80 min，4 ℃、4 000 r·min離心20 min，收集上清液。向其中加入相同體積的去離子水，4 ℃冰箱中靜置24 h，低溫4 000 r·min離心30 min，棄去上清液，將所得沉淀用少量75%乙醇溶液溶解，真空冷凍干燥，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

堿溶性蛋白提取:向提取醇溶性蛋白后殘渣加入0.17 mol·LNaOH溶液100 mL，攪拌均勻。20 ℃超聲提取80 min，4 ℃、4 000 r·min離心20 min，收集上清液，并用0.17 mol·LNaOH溶液定容至100 mL。用乙酸調(diào)節(jié)pH=4.7，加入(NH)SO(43 g)，4 ℃冰箱中靜置 24 h，低溫4 000 r·min離心30 min，棄去上清液，將所得沉淀用少量0.17 mol·LNaOH溶液溶解并轉(zhuǎn)移至透析袋中，密封置于去離子水中，在4 ℃冰箱中靜置24 h，期間每隔3 h換一次去離子水。用10%的BaCl檢驗去離子水，直至無沉淀出現(xiàn)，然后真空冷凍干燥，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 不同多糖組分提取

根據(jù)多糖性質(zhì)不同，采用累進提取法提取水溶性多糖、酸溶性多糖和堿溶性多糖。

水溶性多糖提取:準(zhǔn)確稱取脫脂全麥粉10.0 g于燒杯中，加入0.1 g α-淀粉酶和150 mL蒸餾水，攪拌均勻，在60 ℃條件下超聲提取40 min；然后4 ℃、4 000 r·min離心20 min，收集上清液；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃冰箱中靜置24 h醇沉，用同樣參數(shù)離心獲得沉淀。

蒸餾水稀釋脫蛋白處理：將稀釋液(所得沉淀：HO=1∶5)與sevage試劑(氯仿∶正丁醇=2∶1)2∶1混合，振蕩搖勻，4 ℃、4 000 r·min離心10 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)濃縮，真空冷凍干燥，-18 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

酸溶性多糖提取:向經(jīng)處理后殘渣加入100 mL 0.1 mol·LHCl溶液，攪拌均勻，在20 ℃條件下超聲提取40 min；4 ℃、4 000 r·min離心30 min，收集上清液真空濃縮；加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃冰箱中靜置24 h醇沉，離心獲得沉淀。脫蛋白處理同上。

堿溶性多糖的提?。合蚪?jīng)處理后殘渣加入100 mL 0.1 mol·LNaOH溶液，攪拌均勻，在60 ℃條件下超聲提取40 min；4 ℃、4 000 r·min離心30 min，收集上清液真空濃縮；加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃冰箱中靜置24 h醇沉，離心獲得沉淀。脫蛋白處理同上。

1.2.5 核糖組分提取

參考徐慧等弱堿鹽法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取脫脂全麥粉10.0 g于燒杯中，加入150 mL 6.5%的NaCl溶液，攪拌均勻，在80 ℃條件下超聲提取60 min；4 ℃、4 000 r·min離心 20 min，收集上清液真空濃縮；然后進行脫蛋白處理，用HCl調(diào)節(jié)其pH=2.5，4 ℃冰箱中靜置 12 h，離心棄去上清液，用95%乙醇澆淋沉淀，離心，真空冷凍干燥處理。

1.2.6 抗氧化活性測定

將上述提取的各組分用相應(yīng)提取溶劑進行溶解，設(shè)置不同的濃度梯度進行抗氧化活性研究，以Vc作對照。

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)自由基清除率測定：參考唐艷萍等方法，并稍作修改。試管中加入0.08 mL樣品溶液，加入8.0 mL ABTS 工作液，混勻，于暗處反應(yīng)10 min，利用UN-9000S型上海元析雙光束紫外-可見分光光度計在734 nm處測定吸光值。

清除率=(A-A)/A×100%

式中，A:ABTS工作液吸光度；A:加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光度

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率測定：參考何榮等方法,并稍作修改。

配制0.1 mmol·LDPPH乙醇溶液；在試管中加入0.2 mL樣品溶液，再加入7.8 mL DPPH 乙醇溶液，混勻，于暗處靜置30 min，在517 nm處測定吸光值。

清除率=(A-A)/A×100%

式中，A：DPPH乙醇溶液吸光度；A:加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光度。

Fe還原能力測定(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)：參考劉曠等方法，并稍作修改。配制FRAP工作液，37 ℃水浴保溫備用。將200 μL待測樣品加入試管中，然后加入600 μL蒸餾水、6 mL FRAP工作液迅速混勻，將試管置于37 ℃水浴保溫10 min，在波長593 nm處測定吸光值。

FRAP Fe還原能力以 △A=A-A表示

式中，A:不加樣品的吸光度；A:加入樣品溶液反應(yīng)后測得的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel作圖，用SPSS 13.0中的Duncan進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 運黑14207硒及各活性組分含量分析

運黑14207全麥粉中硒含量為0.185 mg·kg。

由圖1可知，在各提取組分中，水溶性多糖含量最高，為11.08%，其次是堿溶性蛋白、堿溶性多糖，分別為7.07%、2.52%，核糖與水溶性、鹽溶性以及醇溶性蛋白的含量較低，分別為 1.77%、1.77%、1.20%、0.81%，含量最低的是酸溶性多糖，僅為0.25%。

WSP:水溶蛋白；SSP:鹽溶蛋白；ASP:醇溶蛋白；AlSP:堿溶性蛋白；WSPO:水溶性多糖；ASPO:酸溶性多糖；AlSPO:堿溶性多糖；R:核糖。下同。WSP:Water-soluble protein；SSP:Salt-soluble protein；ASP:Alcohol-soluble protein；AlSP:Alkali-soluble protein；WSPO:Water-soluble polysaccharide；ASPO:Acid-soluble polysaccharide；AlSPO:Alkali-soluble polysaccharide；R:Ribose.The same in figures 2-5.圖1 運黑14207不同提取組分得率Fig.1 Extraction rate of different components

2.2 運黑14207不同提取組分的硒含量

由圖2可知，運黑14207籽粒不同提取組分的硒含量不同。蛋白質(zhì)中硒含量最高，顯著高于多糖與核糖中的硒含量(<0.05)，以水溶性蛋白的硒含量最高，為1.53 mg·kg。說明被測活性組分中，硒主要以硒蛋白的形式存在。

圖2 不同組分硒含量比較Fig.2 Comparison of selenium content in different components

由表1可知，運黑14207各提取組分中有機硒含量占總硒含量58.56%。堿溶性蛋白結(jié)合硒占比最多，達23.38%，其次為水溶性蛋白結(jié)合硒，占比為14.72%。說明運黑14207粉中的有機硒主要是以蛋白結(jié)合態(tài)形式存在，且堿溶性蛋白硒占比最高。

表1 各組分硒含量所占總硒比例Table 1 Proportion of selenium content in each component to the total selenium

2.3 被提取活性物質(zhì)的抗氧化活性分析

2.3.1 ABTS自由基清除率比較

由圖3可知，不同提取組分均具有清除ABTS自由基能力,且隨著濃度增加清除能力增強，即其抗氧化性越強。四種蛋白組分中(圖3A)，當(dāng)濃度低于4 mg·mL時，水溶性蛋白對ABTS自由基的清除率最強，其次為醇溶性、鹽溶性、堿溶性蛋白；當(dāng)濃度為5 mg·mL時，堿溶性蛋白對ABTS自由基清除率最強。三種多糖組分中，當(dāng)濃度低于2 mg·mL時，水溶性多糖對ABTS自由基清除率最強，當(dāng)濃度超過3 mg·mL時，堿溶性多糖的清除率大幅提高，5 mg·mL時最高清除率可達65%(圖3B)，相當(dāng)于0.1 mg·mLVc清除率。核糖對ABTS清除率隨濃度變化不明顯。

圖3 不同組分對ABTS自由基清除能力Fig.3 Free radical scavenging ability of different components to ABTS

2.3.2 DPPH自由基清除能力比較

由圖4可知，不同提取組分對DPPH自由基均有清除能力。隨著樣品濃度的增加對DPPH自由基清除率增高，表明其抗氧化性增強。圖4A表明，同一濃度下四種蛋白組分比較，水溶性蛋白的DPPH自由基清除率最強，其次為醇溶性、鹽溶性、堿溶性蛋白。三種多糖組分中，水溶性多糖的DPPH自由基清除率最高，當(dāng)濃度大于 1 mg·mL時清除力超過25%，接近0.15 mg·mLVc清除率，其次是堿溶性多糖和酸溶性多糖，二者清除能力基本相同。核糖提取物對DPPH自由基清除率隨濃度提高而增高，但總清除率低于其他提取物。

圖4 不同組分對DPPH自由基清除能力Fig.4 Free radical scavenging ability of different components to DPPH

2.3.3 Fe還原能力比較

由圖5可知，不同提取組分均具有Fe還原能力，但較對照Vc清除能力均較低。由圖5A可知，同一濃度下四種蛋白組分比較，水溶性蛋白對Fe還原率最高，最大為0.27，相當(dāng)于0.025 mg·mLVc對其清除率，其次為醇溶性、鹽溶性、堿溶性蛋白。三種多糖組分比較，水溶性多糖對Fe還原率最高。核糖對Fe還原率隨著濃度的增加而增大，但對其總清除能力較其他提取物弱。

圖5 不同組分對Fe3+還原能力Fig.5 FRAP of different components to Fe3+

3 討 論

我國將硒含量超過40 μg·kg的谷物定義為富硒谷物，運黑14207硒含量為185 μg·kg，屬于富硒谷物范疇，且有機硒含量占總硒含量58.56%，此結(jié)果與程建中等認(rèn)為植物有機硒占硒總量80%以上不同，主要原因可能與物種、生長環(huán)境和提取方法等有關(guān)。運黑14207中有機硒主要是以蛋白結(jié)合態(tài)形式存在，其占總有機硒含量的78.84%。各組分間硒含量比較，水溶性蛋白中硒含量最高，為1.53 mg·kg，與趙萍等的研究結(jié)果一致；而堿溶性蛋白的硒含量占總硒含量比例最高，為 23.38%，其次是水溶性蛋白。本研究所提取的八活性種組分中，水溶性多糖得率最高，得率為 11.08%，其次是堿溶性蛋白，得率為7.07%。在抗氧化特性研究方面，相同濃度下，水溶性多糖及水溶性蛋白較其他組分對ABTS、DPPH、Fe均具有較高的清除率，但均低于對照Vc。水溶性多糖濃度5 mg·mL時對ABTS自由基清除率最高，達65%，相當(dāng)于0.1 mg·mLVc溶液清除率；水溶性多糖濃度大于1 mg·mL時對DPPH自由基清除率超過25%，接近0.15 mg·mLVc溶液清除率；水溶性蛋白濃度為 5 mg·mL時對Fe還原力最強，為0.27，相當(dāng)于0.025 mg·mLVc溶液清除率。硒多糖是一類由硒和多糖共價結(jié)合而形成的功能性多糖。有研究報道，通過亞硒酸酯化修飾獲得的硒多糖，不但保留了多糖的基本結(jié)構(gòu)和生物功能，而且使其更容易被吸收利用，提高了硒元素的生物利用度，表現(xiàn)出比硒元素和多糖本身更高的抗氧化、降血糖和免疫調(diào)節(jié)活性。

植物是有機硒的最好載體，也是人類最安全的硒源。本研究為運黑14207有機硒的分離純化提供了借鑒，也為富硒成分的富集指明了研究方向。但依然需要對運黑14207中各含硒組分進行進一步工藝優(yōu)化與純化，并對各種含硒組分的結(jié)構(gòu)進行深入研究和分析，且加強相關(guān)富硒功能食品研發(fā)。