豬呼吸道病原綜合診斷

李 昊，周可磊，陳世云，周 軍，馬艷君，羅 鳳

（1.西昌學(xué)院，四川 西昌 615013；2.四川省涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 西昌； 3. 四川省西昌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 西昌；4.四川博策檢查技術(shù)有限公司，四川 成都）

呼吸系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病和繁殖障礙性疾病是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的最常見(jiàn)的三類疾病，其中豬呼吸道類疾病發(fā)生最為普遍，發(fā)病率30 % ～ 80 %，死亡率在5 % ～ 30 %，呼吸道疾病可發(fā)生在豬的各個(gè)日齡段[1]。隨著我國(guó)養(yǎng)豬集約化程度的提高、氣候的劇變以及環(huán)境中病原菌耐藥性的增強(qiáng)，進(jìn)一步加重了豬場(chǎng)豬呼吸道疾病發(fā)生[2-3]。在豬呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生過(guò)程中，免疫抑制性病毒如豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine respiratory and reproductive syndrome virus， PRRSV）的感染或者潛伏感染是重要的病因之一，該類病毒能夠抑制機(jī)體免疫，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，為其他細(xì)菌性病原的的感染提供有利條件[4]。

豬圓環(huán)病毒病是由PCV-2引起的豬的一種免疫抑制的傳染病，其臨診主要特征為消瘦、黃疸、體質(zhì)下降、呼吸困難、腹瀉、母豬繁殖障礙、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化[5]。目前認(rèn)為，PCV-2可以感染豬的一生，不同生產(chǎn)階段的豬感染后臨床表現(xiàn)不同，但是對(duì)成年豬感染后一般呈亞臨床狀態(tài)，并成為重要傳染源之一[6]。豬巴氏桿菌?。⊿wine pasteurellosis）又稱豬肺疫，是由多殺性巴氏桿菌（Pm）引起豬的出血性敗血癥，是一種急性、熱性傳染病。急性型呈出血性敗血癥，呼吸極度困難[5]。慢性型多見(jiàn)于流行后期，主要呈現(xiàn)慢性肺炎或慢性胃腸炎癥。時(shí)發(fā)腹瀉，呈進(jìn)行型營(yíng)養(yǎng)不良，極度消瘦最后衰竭致死，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)極大危害[7]。

2021年3月，四川省西昌市某育肥豬場(chǎng)發(fā)生以呼吸道障礙為特征的疫病，發(fā)病率高達(dá)35 %，死亡率約為8 %。為了準(zhǔn)確診斷引起本次豬呼吸道疾病的病原以及篩選出有效藥物，本試驗(yàn)進(jìn)行了病原的分子檢測(cè)、細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，篩選出了針對(duì)該致病菌的敏感藥物，并有針對(duì)性地提出了治療和防控措施，為發(fā)病豬場(chǎng)疾病的診斷和制定有效的防治措施提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本從發(fā)病場(chǎng)無(wú)菌采集3頭疑似呼吸系統(tǒng)疾病癥狀的病死豬肺組織、淋巴結(jié)和扁桃體樣品放入冰盒，由四川博策檢查技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑和儀器總核酸提取試劑盒購(gòu)自臺(tái)灣瑞基海洋生物科技有限公司，胰蛋白胨大豆瓊脂，抗菌藥物藥敏紙片及微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2XTaq PCR Master Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

用到的主要儀器有：全自動(dòng)核酸提取儀（金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司）、ABI PCR儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）、君意凝膠成像儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、高壓滅菌鍋（馳通儀器（上海）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌和病毒的PCR/RT-PCR鑒定將3頭病死豬（分別編號(hào)1、2、3）對(duì)應(yīng)編號(hào)的肺臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織進(jìn)行等體積混合，加入滅菌生理鹽水進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min 離心2 min。取上清液200 μl進(jìn)行核酸提取，根據(jù)總核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，運(yùn)用常規(guī)PCR和RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，其中，采用16 S通用引物擴(kuò)增的產(chǎn)物送至生物公司測(cè)序。所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成，詳細(xì)序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.2.2 細(xì)菌分離和生化鑒定選取肺組織病變嚴(yán)重部位并置于超凈臺(tái)中，用酒精棉對(duì)其表面消毒，用無(wú)菌手術(shù)剪取深部組織并涂布于含有5 %新生牛血清的TSA平板上，接種環(huán)劃線，置于37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)12～48 h后進(jìn)行肉眼觀察，挑取優(yōu)勢(shì)單菌落接種于含有5 % 新生牛血清的TSB液體培養(yǎng)基中，在160 r/min、37 ℃ 搖床中進(jìn)行純化培養(yǎng)。分別勾取純培養(yǎng)物無(wú)菌接種于生化試驗(yàn)培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h后判定結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)將純化成功的菌種采用滅菌生理鹽水進(jìn)行清洗，稀釋后并與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷岷筮x取濃度為3×108個(gè)活菌/ml，吸取0.1 ml菌液均勻涂布在整個(gè)血清瓊脂培養(yǎng)基上，在超凈工作臺(tái)中干燥3～5 min后貼上杭州微生物試劑有限公司的藥敏紙片（青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢曲松、新霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、硫酸新霉素、慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、諾氟沙星），于37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h后根據(jù)說(shuō)明書(shū)的判定標(biāo)準(zhǔn)確定藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病豬病理剖檢變化

發(fā)病豬群精神沉郁、體溫升高、呼吸困難、口鼻流白色泡沫。剖檢發(fā)現(xiàn)氣管內(nèi)有大量泡沫黏液（圖1A），肺臟充血、出血、淤血（圖1B）。

圖1 病豬病理剖檢變化

2.2 細(xì)菌和病毒的PCR/RT-PCR鑒定

病原分子檢測(cè)結(jié)果表明3頭豬均呈PCV-2陽(yáng)性，而PRRSV、PRV和CSFV呈陰性，結(jié)果見(jiàn)圖2；表明發(fā)病豬群主要為PCV-2感染。

圖2 病原PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 細(xì)菌的分離鑒定

肉眼觀察菌落呈灰白色、光滑、濕潤(rùn)的菌落；挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏及瑞氏染色，革蘭氏染色呈陰性細(xì)小桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染的細(xì)菌。在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)，生化試驗(yàn)結(jié)果為葡萄糖、蔗糖、果糖陽(yáng)性，乳糖、阿拉伯糖、吲哚陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，甲基紅、石蕊、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性，初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。為了進(jìn)一步確定病原，用16S通用引物檢測(cè)細(xì)菌，結(jié)果擴(kuò)增到1465bp目的片段，將該片段純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI Blast序列比對(duì)分析，該分離菌為巴氏桿菌。

圖3 16S rRNA PCR檢測(cè)結(jié)果

以上結(jié)果表明導(dǎo)致本場(chǎng)本次發(fā)病的病原為PCV-2和巴氏桿菌混合感染。

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)

如表2所示，分離菌株對(duì)頭孢曲松、諾氟沙星、環(huán)病沙星、丁胺卡那等13種藥物表現(xiàn)出了不同程度的敏感性，其中高敏藥物10種，中敏藥物3種，耐藥藥物3種（青霉素、阿莫西林和氟苯尼考）。

表2 分離菌株對(duì)16種藥物的敏感性

3 討論

目前我國(guó)許多養(yǎng)豬場(chǎng)呼吸道疾病病原復(fù)雜，臨床生產(chǎn)中多以混合感染和繼發(fā)感染為主[8]。引起豬呼吸道疾病原發(fā)性病原主要有PCV-2、PRRSV、PRV、CSFV、胸膜肺炎放線桿菌和豬肺炎支原體等，繼發(fā)性病原主要有巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌等，尤其是PCV-2和PRRSV感染肺泡巨噬細(xì)胞，可引起嚴(yán)重免疫抑制，造成呼吸系統(tǒng)抵抗力下降，導(dǎo)致豬繼發(fā)感染等[9]。此外豬場(chǎng)濫用抗生素導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，致使發(fā)病后抗菌藥物治療效果不佳甚至無(wú)效果，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[9]。

豬群攜帶圓環(huán)病原是PCV感染的必要條件，在飼養(yǎng)管理不善、通風(fēng)不良、溫濕度不適、免疫接種應(yīng)激、不同來(lái)源和日齡的豬群混養(yǎng)等原因可綜合導(dǎo)致豬群出現(xiàn)明顯的臨床癥狀病帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV感染引起免疫抑制，造成呼吸系統(tǒng)抵抗力下降，進(jìn)而導(dǎo)致豬群易繼發(fā)巴氏桿菌感染[10]。豬場(chǎng)可采取以下措施防控圓環(huán)病毒感染豬群：分區(qū)飼養(yǎng)，全進(jìn)全出；加強(qiáng)疫苗的免疫，選擇針對(duì)該場(chǎng)現(xiàn)有毒株的高抗原含量疫苗，制定合理的疫苗免疫程序；加強(qiáng)生物安全措施，避免交叉感染[11]。

巴氏桿菌廣泛存在于正常豬的上呼吸道、扁桃體等器官和組織中，因而豬群巴氏桿菌的帶菌率與豬群是否發(fā)生豬巴氏桿菌病并無(wú)直接關(guān)系[12]。一般認(rèn)為動(dòng)物在發(fā)病前已經(jīng)帶菌，當(dāng)各種誘因使機(jī)體抵抗力降低時(shí)，病原菌即可乘虛侵入體內(nèi)，經(jīng)淋巴液進(jìn)入血流，發(fā)生內(nèi)源性感染[5]。目前，臨床上控制豬巴氏桿菌病最有效、最快速的方法是使用抗菌藥物進(jìn)行治療，但是隨著抗菌藥物大量、盲目的濫用，細(xì)菌的耐藥性亦越來(lái)越嚴(yán)重，給食品安全和人類健康造成潛在的威脅。王久紅等[13]研究表明，豬巴氏桿菌分離株對(duì)對(duì)大部分抗生素敏感，尤其是恩諾沙星、環(huán)丙沙星等沙星類抗生素，而鏈霉素、慶大霉素等藥物對(duì)其抑制效果不明顯，僅對(duì)林可霉素產(chǎn)生耐藥性。胡星星等[14]研究表明，豬巴氏桿菌部分分離株對(duì)強(qiáng)力霉素、青霉素類、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對(duì)較高，而對(duì)對(duì)氧氟沙星、多粘菌素B、頭孢類和阿莫西林相對(duì)敏感。本研究中的分離菌株對(duì)多種藥物高度敏感，為發(fā)病豬場(chǎng)篩選出了治療性藥物，但是本研究中的分離菌株已對(duì)3種藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。綜合以上研究結(jié)果可以看出，豬巴氏桿菌在不同地域分離株對(duì)不同藥物均已產(chǎn)生了一定的耐藥性，其整體耐藥性的發(fā)展趨勢(shì)不容樂(lè)觀，應(yīng)加強(qiáng)重視。

豬場(chǎng)呼吸道疾病是威脅豬群健康和導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)嚴(yán)重?fù)p失的主要疾病，本案例對(duì)豬出現(xiàn)明顯的呼吸道等癥狀的病原進(jìn)行檢測(cè)，為PCV-2和巴氏桿菌混合感染所致，在此結(jié)果基礎(chǔ)上，采取了將發(fā)病豬隔離，避免疫情擴(kuò)散，緊急免疫。豬場(chǎng)使用高抗原含量的PCV-2疫苗進(jìn)行緊急免疫，需注意一豬一針頭。同時(shí)建議使用頭孢曲松等高度敏感類藥物進(jìn)行肌肉注射，連續(xù)治療3～5 d，觀察患病豬的恢復(fù)情況或用恩諾沙星連續(xù)拌料5 d，停藥7 d后使用環(huán)丙沙星連續(xù)拌料5 d，均按說(shuō)明書(shū)劑量使用，或用用恩諾沙星飲水連續(xù)給藥5 d，用于保健和預(yù)防。給藥前豬群停水2 h，再讓豬群自由飲用。同時(shí)加強(qiáng)環(huán)境消毒和飼養(yǎng)管理，實(shí)行全進(jìn)全出生產(chǎn)模式，禁止混群，對(duì)發(fā)病豬及時(shí)隔離，并對(duì)病死豬進(jìn)行無(wú)害化處理。加強(qiáng)消毒，每批次豬群轉(zhuǎn)移后充分消毒并空欄7 d。加大空氣流通，降低豬舍內(nèi)氨氣含量，改善欄舍空氣質(zhì)量。加強(qiáng)對(duì)飼養(yǎng)人員的管理，避免串欄，在進(jìn)入豬舍前一定要消毒。通過(guò)以上措施，快速控制了疫情，降低了豬群的死亡率，為豬場(chǎng)挽回了損失。

現(xiàn)階段，非洲豬瘟給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失，豬場(chǎng)應(yīng)提高生物安全防控意識(shí)，及時(shí)隔離發(fā)病豬只，并做好消毒工作，在防控非洲豬瘟的同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)PRRSV、PCV-2和PRV等病毒性病原的防控，凈化這些疫病，提高豬場(chǎng)效益。本案例通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷和豬場(chǎng)獸醫(yī)的臨床診斷結(jié)合，做出了合理的綜合診斷。并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，制定了一系列針對(duì)性的治療及防控措施，通過(guò)連續(xù)跟蹤回訪，顯示該措施切實(shí)可行，為豬場(chǎng)圓環(huán)病毒和巴氏桿菌病的診斷和防控提供了基本原則和數(shù)據(jù)上的支持。