器官芯片在腎臟疾病研究中的應(yīng)用

黃 威 陳怡園 綜述 何方方 審校

器官芯片是一種在芯片上模擬器官功能的微系統(tǒng),以微流控技術(shù)為核心,與細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)等多種方法相結(jié)合,是近幾年快速發(fā)展的前沿科學(xué)技術(shù),已廣泛應(yīng)用于疾病研究、新藥篩選和毒性預(yù)測[1]。在腎臟領(lǐng)域,器官芯片主要用于構(gòu)建體外模型,以研究腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制。此外,在新藥臨床試驗(yàn)中,腎臟芯片憑借其高仿真性被視為良好的體外模型,成為新藥研發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。本文通過追溯微流控技術(shù)在腎臟病領(lǐng)域的應(yīng)用案例,闡述器官芯片在腎臟疾病中的應(yīng)用進(jìn)展,探討腎臟芯片的發(fā)展前景。

器官芯片簡介

發(fā)展史自20世紀(jì)90年代以來,微流控技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域交叉衍生出多種新技術(shù),器官芯片即為其中之一[3]。器官芯片是一種微流體細(xì)胞培養(yǎng)裝置,可模擬器官的關(guān)鍵功能單元和微環(huán)境要素。之所以被稱為“芯片”,是因?yàn)槠渥畛跏抢弥圃煊?jì)算機(jī)芯片的方法制備的[4]。2010年,Huh等[5]研制出第一個(gè)器官芯片——肺芯片,標(biāo)志著器官芯片初級(jí)功能化的實(shí)現(xiàn)。該研究發(fā)表以來,多個(gè)研究小組相繼構(gòu)建出肝、腸、胎盤、腎臟等器官芯片[4],涉及藥物研發(fā)和疾病研究等多個(gè)領(lǐng)域。

組成器官芯片是通過2D或3D培養(yǎng)方式將細(xì)胞培養(yǎng)于由單個(gè)至多個(gè)微通道組成的微流體裝置中,微通道中多孔膜的兩側(cè)可分別培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞,再給予物理或化學(xué)信號(hào)刺激,以模擬體內(nèi)的3D環(huán)境[4,6-7]。

優(yōu)缺點(diǎn)器官芯片技術(shù)可使用人類來源的細(xì)胞,還能提供液體流動(dòng)、機(jī)械信號(hào)以及器官水平的組織界面,能更真實(shí)地模擬人體器官的三維結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境[2]。此外,器官芯片可模擬器官的最小功能單元,所需材料少,可實(shí)現(xiàn)大量樣本的并行實(shí)驗(yàn)[8]。由于裝置的光學(xué)透明性,研究者可直接在細(xì)胞水平觀察生理活動(dòng),這在活體器官中很難做到[9]。器官芯片可對(duì)各腔室分別進(jìn)行研究,還可單獨(dú)調(diào)整培養(yǎng)參數(shù),為研究分子、化學(xué)和物理信號(hào)如何單獨(dú)或組合發(fā)揮作用提供了工具[4]。

器官芯片也存在局限性。例如,目前器官芯片最長培養(yǎng)時(shí)間約為4周,不適用于某些耗時(shí)較長的實(shí)驗(yàn)[10]。灌注流體通道中常出現(xiàn)氣泡或灰塵,由于裝置尺寸較小,這些物質(zhì)很難去除,可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]。另外,不同制造商或不同實(shí)驗(yàn)室制作出的器官芯片存在性能上的差異,影響實(shí)驗(yàn)的均一性[4]。

腎臟芯片的應(yīng)用

腎小管芯片腎小管芯片由血液極塊、尿液極塊及兩者間的多孔膜組成,極塊多以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料,多孔膜兩側(cè)分別種有血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞,血液極塊中的液體流經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞,尿液極塊的液體流經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞,兩條通路中的成分通過多孔膜進(jìn)行交換,能有效模擬腎小管的功能(未發(fā)表資料)。

藥物腎毒性評(píng)價(jià) 近端小管是藥物清除的主要部位,也是藥物腎毒性的主要靶點(diǎn),但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性使得藥物的腎毒性常在臨床試驗(yàn)晚期才被發(fā)現(xiàn),由于腎小管芯片能更準(zhǔn)確及時(shí)地評(píng)估腎小管受損程度,目前可用于藥物篩選與藥代動(dòng)力學(xué)研究。

Jang等[11]將順鉑流動(dòng)狀態(tài)與靜態(tài)的腎毒性進(jìn)行比較,結(jié)果表明,在流動(dòng)狀態(tài)下,順鉑誘導(dǎo)的腎小管毒性明顯低于靜態(tài),這可能是臨床上通過液體輸注預(yù)防順鉑腎毒性的原理。Kim等[12]設(shè)計(jì)了一種腎小管芯片研究慶大霉素的腎毒性。研究者以相同劑量,分別通過1次/d大劑量和連續(xù)輸注兩種方法給藥,結(jié)果顯示前者可降低細(xì)胞毒性,并使上皮細(xì)胞保持低滲,證明慶大霉素的腎毒性與其給藥方式相關(guān)。Alder等[13]在體外將人近端小管上皮細(xì)胞(HPTECs)暴露于腎毒性物質(zhì)后進(jìn)行多基因表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)只有編碼血紅素加氧酶1的基因過表達(dá)與毒性物質(zhì)劑量增加有關(guān),該研究成功利用腎小管芯片發(fā)現(xiàn)了新的腎毒性生物標(biāo)志物。這些研究成果提示腎小管芯片在新藥篩選和毒性預(yù)測方面具有很大的潛力。

模擬腎纖維化 腎纖維化的形成機(jī)制尚無定論,有研究顯示上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)可能在此過程中發(fā)揮重要作用[14],但缺乏可監(jiān)測EMT過程的體外模型。為此,Zhou等[15]利用人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)制備腎小管芯片重現(xiàn)了EMT過程。研究者在流體狀態(tài)下觀察到暴露于血清蛋白的HK-2出現(xiàn)類似于體內(nèi)EMT的過程。該實(shí)驗(yàn)在上皮細(xì)胞周圍建立與體內(nèi)類似的微環(huán)境,這是傳統(tǒng)方法無法實(shí)現(xiàn)的。

模擬腎結(jié)石形成 關(guān)于結(jié)石形成機(jī)制,既往研究主要通過提取結(jié)石的成分間接得出結(jié)論,缺乏真實(shí)的動(dòng)力學(xué)因素,對(duì)其機(jī)制的研究難以深入[16]。Wei等[17]將HK-2培養(yǎng)于管狀微流體裝置中,在顯微鏡下原位監(jiān)測磷酸鈣在小管中的沉積,以觀察結(jié)石形成的生物學(xué)過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)腔內(nèi)鈣濃度增加時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣濃度也隨之增加,而將氯化鈣和磷酸三鈉的混合溶液注入裝置時(shí),可觀察到磷酸鈣結(jié)石的形成。這是首個(gè)通過實(shí)時(shí)誘導(dǎo)腎小管結(jié)石形成來研究其產(chǎn)生機(jī)制的研究。

腎小球芯片腎小球芯片的構(gòu)建與腎小管芯片類似,多孔膜上涂有基質(zhì),兩側(cè)為原代腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞,形成腎小球?yàn)V過屏障(GFB),當(dāng)液體通過時(shí)可模擬體內(nèi)血液濾過的過程(圖1)。體外培養(yǎng)足細(xì)胞難度較大,限制了腎小球芯片的發(fā)展,但由多能干細(xì)胞衍生的足細(xì)胞的出現(xiàn)有望克服這一難題[19]。

圖1 腎小球芯片示意圖PDMS:聚二甲基硅氧烷;腎小球芯片由PDMS制作而成,模型中的上下層液體流通通道與外界液體相連,兩層之間由有孔的基膜分隔開,上層模擬血管腔,種有血管內(nèi)皮細(xì)胞,下層模擬尿液腔,種有足細(xì)胞,上層液體可經(jīng)基膜流入下層,這三層結(jié)構(gòu)可模擬腎小球?yàn)V過屏障

模擬糖尿病腎病(DN) DN是終末期腎病的主要原因,但其發(fā)病機(jī)制目前尚無定論[19]。Wang等[20]制備了一種腎小球芯片模擬DN,結(jié)果顯示,高血糖時(shí)腎小球?qū)Π椎鞍椎耐ㄍ感燥@著增加,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1表達(dá)增加,活性氧產(chǎn)生增加,但緊密連接蛋白1表達(dá)減少,證明該芯片成功模擬DN的病理生理過程,為DN發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路。

模擬高血壓腎病(HN) 目前,關(guān)于HN的研究一直缺乏能調(diào)節(jié)機(jī)械力的體外模型。Zhou等[21]設(shè)計(jì)了一種腎小球芯片,可通過調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)因素制備HN模型。該裝置由毛細(xì)血管通道和襯有足細(xì)胞的尿路通道組成,當(dāng)培養(yǎng)基流過毛細(xì)血管通道時(shí),會(huì)產(chǎn)生縱向流體剪切應(yīng)力模擬腎小球的濾過作用,在此基礎(chǔ)上增加流速會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)血管壓力增加,形成類似HN的病理狀態(tài)。結(jié)果表明,當(dāng)流速增加時(shí),細(xì)胞內(nèi)形成應(yīng)力纖維,血管內(nèi)皮受損,足細(xì)胞標(biāo)志分子nephrin和podocin的表達(dá)降低,GFB對(duì)白蛋白的通透性顯著增加。這些結(jié)果表明腎小球芯片可用于研究HN的機(jī)制。

腎單位芯片單獨(dú)的腎小管芯片和腎小球芯片只能模擬腎單位的部分功能,得到的數(shù)據(jù)可能較為片面。為更全面的模擬腎單位的結(jié)構(gòu)和功能,需要構(gòu)建完整的腎單位芯片。腎單位芯片包含腎小球與腎小管裝置,腎小球裝置由上下兩個(gè)腔室構(gòu)成,分別模擬腎小球和包囊,中間多孔膜兩側(cè)種有腎微血管內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞,液體中的物質(zhì)可由腎小球過濾至包囊,模擬濾過作用;同樣,腎小管裝置分為管周毛細(xì)血管和小管腔,多孔膜兩側(cè)分別種有血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞,液體成分可由后者轉(zhuǎn)運(yùn)回前者,類似重吸收過程。再將腎小球與管周血管、包囊與小管腔分別以微通道相連,形成完整的流動(dòng)系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)了功能性腎小球和腎小管的共培養(yǎng)[22](圖2)。

圖2 腎單位芯片示意圖腎單位芯片由腎小球和腎小管兩部分裝置組成,上層血管腔模擬腎小球微血管和管周毛細(xì)血管,種有血管內(nèi)皮細(xì)胞;下層尿液腔模擬尿路通道,腎小球部分種有足細(xì)胞,而腎小管部分分別種有近端小管上皮細(xì)胞和集合管細(xì)胞,上下兩層通道中的液體可經(jīng)有孔的基膜相互交通,該芯片可模擬腎小球的濾過功能和腎小管的重吸收和內(nèi)分泌功能

藥物腎毒性評(píng)價(jià) 有研究者構(gòu)建了一種腎單位芯片,該芯片的腎小球單元具有機(jī)械屏障和電荷屏障作用,腎小管單元可重吸收葡萄糖、分泌對(duì)氨基馬尿酸,證明該芯片具有良好的仿真性(未發(fā)表資料)。研究者利用該裝置考察腎單位對(duì)順鉑的響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)當(dāng)順鉑分別施加于小管與頂端膜時(shí),細(xì)胞損傷程度有差異,并且管周血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的腎損傷有保護(hù)作用,這些結(jié)果與體內(nèi)情況相似。實(shí)驗(yàn)還比較了順鉑對(duì)腎單位芯片和腎小管芯片中小管上皮細(xì)胞損傷程度的差異。在同等給藥情況下,腎單位芯片損傷程度更輕,說明利用腎單位芯片進(jìn)行藥物篩選可能比腎小管芯片更加真實(shí)可靠。

模擬腎毒性 有研究者將大鼠原代足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞按照一定比例接種在芯片上,研究中草藥商陸有效成分商陸皂苷甲對(duì)腎臟細(xì)胞的損傷(未發(fā)表資料)。結(jié)果表明,該芯片能較好地維持大鼠原代腎臟細(xì)胞的生長狀態(tài),通過染色表征不同濃度的商陸皂苷甲對(duì)腎臟細(xì)胞的損傷情況,成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)中草藥成分的腎毒性篩選。

包含腎臟功能的多器官芯片體內(nèi)各器官間的相互作用在單器官芯片中難以實(shí)現(xiàn),使得多器官芯片逐漸引起了研究人員的重視[23-25]。包含腎臟在內(nèi)的多器官芯片不僅在藥物代謝與疾病建模方面具有良好的發(fā)展?jié)摿?還可研究器官間的相互關(guān)系。

在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用 藥物在小腸中吸收、肝臟代謝以及腎臟排泄的過程決定了其療效和安全性。為研究多器官的系統(tǒng)性反應(yīng),Maschmeyer等[10]在4個(gè)培養(yǎng)室中分別接種人源性細(xì)胞構(gòu)建腸、肝、腎小管和皮膚類似物,再將腸、肝和皮膚腔室相連形成血流回路,腎腔和微通道相連形成排泄回路。腸腔允許藥物吸收,肝室能進(jìn)行物質(zhì)代謝,腎腔可排泄藥物,皮膚隔室可用作替代吸收途徑(圖3)。該芯片實(shí)現(xiàn)了四種器官的共培養(yǎng),可用于檢測特定藥物的藥代動(dòng)力學(xué),包括吸收、分布、代謝和排泄情況,這也是第一個(gè)在體外利用微流控模型對(duì)藥物進(jìn)行全身毒性測試的研究。

圖3 多器官芯片示意圖[10]該多器官芯片由四部分組成,可模擬藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程;腸腔由人原代小腸上皮細(xì)胞構(gòu)建,模擬藥物的腸道吸收過程;皮膚隔室由人活檢皮膚組織構(gòu)建,模擬藥物的皮膚吸收過程;肝室由肝癌細(xì)胞和人原代肝星狀細(xì)胞組成的肝臟類似物,模擬藥物的代謝過程;腎腔由人近端小管上皮細(xì)胞株構(gòu)建,模擬代謝產(chǎn)物的排泄過程;紅色為血流回路,黃色為排泄回路

器官間的相互作用 Zhang等[26]開發(fā)了一種包含肝臟、肺臟、腎臟和脂肪細(xì)胞的微流控裝置。四個(gè)培養(yǎng)室相互串聯(lián),不僅能模擬器官間的聯(lián)系,還能實(shí)現(xiàn)功能分離。實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化生長因子β1可激活肺隔間中的細(xì)胞,而不損害其他器官的功能。Choucha-Snouber等[27]設(shè)計(jì)了一種肝腎共培養(yǎng)器官芯片,即在兩個(gè)培養(yǎng)室中分別培養(yǎng)肝細(xì)胞和腎細(xì)胞,肝室中的培養(yǎng)基可流入腎室,在肝室內(nèi)形成的異環(huán)磷酰胺代謝物氯乙醛可使腎細(xì)胞的數(shù)量顯著減少,證明了肝臟代謝產(chǎn)物氯乙醛的腎毒性。由此可見,多器官芯片能揭示器官間的相互作用。

總結(jié)與展望

器官芯片作為一種新興技術(shù),憑借對(duì)組織器官的準(zhǔn)確模擬和對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的精確調(diào)控,已逐漸應(yīng)用于多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。與腎臟領(lǐng)域的交叉,為藥代動(dòng)力學(xué)研究和腎臟疾病模型的建立注入了新的動(dòng)力。目前的腎臟芯片尚存在諸多不足,但在提高腎臟結(jié)構(gòu)功能的認(rèn)識(shí)及對(duì)腎臟疾病的個(gè)性化治療等方面仍然具有很大幫助[28]。

現(xiàn)有腎臟芯片主要由單一的細(xì)胞類型組成,而腎臟的許多功能與心臟、肝臟、肺和腸道等遠(yuǎn)處臟器密切相關(guān),腎臟與這些臟器的相互作用也是心腎綜合征、肝腎綜合征等一些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)[29-30],所以單一的腎臟芯片可能無法完全真實(shí)地反映腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展,提示包含腎臟的多器官芯片可能是未來的研究熱點(diǎn)。