病原體宏基因檢測(cè)在腎臟疾病感染患者中的應(yīng)用

陳江華 王仁定

1998年提出的宏基因組概念最初指土壤標(biāo)本中所有微生物基因組信息的總和,包括無法培養(yǎng)的基因組信息。后來宏基因組概念被應(yīng)用于臨床標(biāo)本中的生物遺傳信息特征。宏基因組二代測(cè)序(mNGS)主要通過以二代測(cè)序?yàn)榇淼母咄繙y(cè)序技術(shù),對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行宏基因組學(xué)分析,從而獲取病原體的分類、血清型、耐藥性以及毒力等一系列生物學(xué)信息。

mNGS是一種直接從患者標(biāo)本中檢測(cè)樣本中的所有核酸, 并按等位擴(kuò)增和測(cè)序,允許對(duì)所有微生物組(即細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌)、耐藥性標(biāo)記物、毒力因子、甚至與不同疾病狀態(tài)相關(guān)的宿主生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。這提供了直接從患者標(biāo)本進(jìn)行無假設(shè)診斷的優(yōu)勢(shì)。mNGS已被證明是檢測(cè)多個(gè)部位感染的成功診斷工具,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道、胃腸道、人工關(guān)節(jié)、泌尿道和眼部。鑒定出的各種病原體包括細(xì)菌、分枝桿菌、RNA和DNA病毒、酵母和霉菌、寄生蟲。mNGS在檢測(cè)新的、例罕見和非典型病因或接受過治療的患者中尤其成功,因此mNGS 也作為人群中發(fā)現(xiàn)潛在危險(xiǎn)和(或)突發(fā)病毒的理想工具。目前在腎臟疾病領(lǐng)域主要集中在腎移植供受體圍手術(shù)期精準(zhǔn)化治療、明確免疫功能低下肺部感染病原菌以及部分泌尿系統(tǒng)感染的檢測(cè)。

mNGS助力腎移植供受體圍手術(shù)期精準(zhǔn)化治療

目前我國(guó)腎移植的供體主要來源親屬活體捐獻(xiàn)和公民死亡后捐獻(xiàn),特別是公民死亡后捐獻(xiàn)的供體,由于重癥捐獻(xiàn)者都在監(jiān)護(hù)室救治,需要?dú)夤懿骞?可能使用大量廣譜抗生素等繼發(fā)病毒、耐藥菌、真菌等病原菌感染。對(duì)供體的相關(guān)體液包括裝載供體器官的保存液進(jìn)行mNGS檢測(cè),可以在器官植入受體前或術(shù)后盡早獲得相關(guān)病原菌和病原菌耐藥信息,對(duì)決定器官的使用與否,以及器官移植后的精準(zhǔn)抗感染治療具有重要的意義。

對(duì)于器官移植受者,由于術(shù)后早期需要使用大劑量免疫抑制劑,對(duì)T細(xì)胞和(或)B細(xì)胞進(jìn)行抑制和清除,感染表現(xiàn)常不典型和被掩蓋,盡管可以采取相關(guān)體液培養(yǎng),但由于術(shù)后抗生素的使用和培養(yǎng)的時(shí)效性問題,使培養(yǎng)結(jié)果的陽性率較低和及時(shí)性較差。對(duì)受體的相關(guān)體液包括創(chuàng)口引流液進(jìn)行mNGS檢測(cè), 可以盡早發(fā)現(xiàn)感染病原菌,盡量避免“大包圍”抗生素使用;同時(shí)對(duì)于無感染依據(jù)的受體,可盡早降低抗生素使用級(jí)別,實(shí)現(xiàn)圍手術(shù)期的精準(zhǔn)抗感染治療。我們對(duì)270例公民死亡后捐獻(xiàn)供腎的術(shù)后引流液采用 mNGS檢測(cè)監(jiān)控, 實(shí)現(xiàn)了無供體來源的真菌、耐藥菌導(dǎo)致的受體死亡和感染性血管破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥,同時(shí)明顯降低了抗生素使用級(jí)別和療程。

mNGS在明確免疫功能低下肺部疾病中扮演重要角色

免疫性腎臟疾病患者常長(zhǎng)期接受免疫抑制治療,易造成機(jī)體免疫功能低下。免疫功能低下患者的傳染病及感染診斷具有獨(dú)特的挑戰(zhàn)性。這一人群中的患者通常出現(xiàn)不尋常病原體感染,具有常見病原體的非典型表現(xiàn),并且更容易合并感染。對(duì)免疫功能低下患者的感染性疾病評(píng)估可能會(huì)耗費(fèi)臨床醫(yī)生的時(shí)間和資源,可能需要大量的微生物學(xué)診斷測(cè)試來確定致病病原體或排除感染。

耶氏卡氏肺囊蟲感染在免疫低下沒有采用有效預(yù)防的患者中,常導(dǎo)致嚴(yán)重肺部感染甚至患者死亡。既往對(duì)于此類的有效診斷是肺泡灌洗液中通過六胺銀染色發(fā)現(xiàn)囊蟲或通過吉姆薩染色確診卡氏肺囊蟲滋養(yǎng)體,特別是后者的判定需要經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)者才能確診。相關(guān)研究包括我們的研究提示采用mNGS對(duì)肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)可以明確是否存在耶氏卡氏肺囊蟲感染;肺泡灌洗的實(shí)現(xiàn)需要病人能夠耐受氣管鏡檢查或已經(jīng)在呼吸機(jī)呼吸支持的患者,對(duì)于沒有呼吸機(jī)支持而不能耐受肺泡灌洗的肺部感染患者,肺泡灌洗液的mNGS則無法采用;我們的臨床實(shí)踐提示采用外周血mNGS同樣可以明確診斷耶氏卡氏肺囊蟲感染。mNGS可以提前明確卡式肺囊蟲感染,為后續(xù)治療提供有力病源學(xué)依據(jù)。

免疫低下患者常存在特殊病毒感染和真菌感染, 如巨細(xì)胞病毒感染可以導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部感染甚至呼吸衰竭。既往的研究提示器官移植后曲霉菌感染75%的病例是臨床診斷, 僅有25%是病原菌確診的。另外,特別是預(yù)后極差的毛霉菌感染對(duì)臨床的診治帶來了極大的挑戰(zhàn)。mNGS可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒感染,并能明確是否合并其他病原菌感染和感染類型,包括少見的病原菌感染(如馬爾尼菲青霉菌),盡早明確病原菌可以為治療贏得時(shí)間,挽救患者生命。 mNGS在免疫低下患者特別是肺部感染的病原診斷中扮演相當(dāng)重要的角色。

mNGS檢測(cè)在泌尿系統(tǒng)感染的意義

尿液培養(yǎng)是診斷尿路感染的金標(biāo)準(zhǔn),目前有mNGS檢測(cè)應(yīng)用于泌尿系感染的研究,尤其是在某些特殊情況下具有更多的優(yōu)勢(shì)。但對(duì)于一般的尿路感染,最常見的細(xì)菌為大腸桿菌,普通的尿液培養(yǎng)可以有效明確病原菌同時(shí)可以明確病原菌的藥敏,mNGS由于較高醫(yī)療費(fèi)用及無法給出細(xì)菌的藥敏,在普通泌尿系感染中并不具有優(yōu)勢(shì)。對(duì)于非免疫低下的病患,泌尿系真菌感染比較少見,但對(duì)于免疫低下患者,尿液真菌培養(yǎng)可以獲得臨床效果,mNGS可以作為一項(xiàng)替代的檢測(cè)方法,能比較快速地明確真菌感染類型。泌尿系感染中病毒感染少見,常規(guī)的培養(yǎng)無法明確,mNGS優(yōu)勢(shì)明顯,可以明確病毒類型,特別是對(duì)于腎移植術(shù)后多瘤病毒感染患者, 我們的研究提示采用目標(biāo)區(qū)域捕獲二代測(cè)序方法對(duì)鑒別多留病毒腎病和急性T細(xì)胞介導(dǎo)的小管間質(zhì)性排斥具有一定的意義;對(duì)于特殊的尿路感染如結(jié)核桿菌,由于培養(yǎng)耗時(shí),mNGS具有較好的時(shí)效性。另外如在免疫力低下的情況下,可能出現(xiàn)少見的馬爾尼菲青霉菌感染,此類真菌容易被檢驗(yàn)科醫(yī)師所忽略,mNGS具有確診優(yōu)勢(shì)。臨床實(shí)踐中,腎活檢病理中存在間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和(或)腎小管中有白細(xì)胞管型的疑似感染性相關(guān)間質(zhì)性腎炎,在無法明確病原菌感染時(shí),mNGS可能通過對(duì)尿液標(biāo)本和腎臟組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)感染病原微生物。因此,在尿路感染中,mNGS在病毒性尿路感染、真菌性尿路感染以及特殊尿路感染如結(jié)核、馬爾尼菲青霉菌等感染的鑒別診斷中具有優(yōu)勢(shì)。

mNGS在腎臟疾病領(lǐng)域特別是免疫低下患者中具有較好的應(yīng)用前景,該檢測(cè)對(duì)臨床樣本直接進(jìn)行檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)少見病、不典型及新型病原學(xué)。對(duì)于無法培養(yǎng)的病毒感染、已暴露在抗生素下以及生長(zhǎng)緩慢的病原菌如真菌等具有輔助診斷作用,能夠提供基于精確醫(yī)學(xué)的診斷方法。但臨床醫(yī)師在使用和解讀MNGS時(shí)必須了解這些方法的差異和局限性。如mNGS程序中是否包含基于RNA的方法,是否對(duì)胞內(nèi)菌采用了破壁處理,檢測(cè)結(jié)果是否反映臨床感染還是定植,是否存在污染等問題進(jìn)行綜合判斷。