脂肪組分染色質(zhì)免疫共沉淀研究方法的建立

許 昆 張 靜 楊敬平 劉志紅

染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)[1-2]是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)-蛋白質(zhì)相互作用。它基于與目標蛋白質(zhì)相互作用的DNA富集,從而確定各種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TF)[3]、組蛋白[4-5]和其他蛋白質(zhì)[6]結(jié)合位點的位置。TF結(jié)合位點和共價修飾組蛋白的全基因組分析對于拓寬對基因組如何部署以實現(xiàn)特定基因調(diào)控的理解至關(guān)重要。ChIP與隨后的高通量測序分析(ChIP-sequence,ChIP-seq)相結(jié)合[7-9],已成為識別全基因組蛋白質(zhì)結(jié)合位點和了解蛋白質(zhì)在細胞身份基礎(chǔ)上發(fā)揮作用最泛用和最有效的方法。影響ChIP實驗的因素有很多,如組織或細胞的類型、樣品的起始量、抗體質(zhì)量和獲取的染色質(zhì)質(zhì)量等。因此,有必要優(yōu)化每種組織或細胞類型的染色質(zhì)制備方案,以提高ChIP實驗質(zhì)量。

脂肪是代謝過程中能量儲存和產(chǎn)熱的組織[10],同時在免疫過程中釋放炎癥因子,還可以通過分泌脂肪因子在內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮作用[11-13]。這歸因于脂肪細胞組成包括了成熟脂肪細胞以及血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction, SVF)細胞[14]。成熟脂肪細胞中大量的油脂使得脂肪組分的ChIP實驗極具挑戰(zhàn),導(dǎo)致細胞組分分離和從細胞中回收DNA的過程特別困難。此外,由于某些部位脂肪組分細胞數(shù)量有限,ChIP應(yīng)用受限。因此研究人員更傾向于僅在組織水平研究體內(nèi)脂肪[15]或僅研究能夠提供足夠樣本量的部位,如性腺脂肪[16-17]。為了研究特定的脂肪組分和每個脂肪部位,有必要提高脂肪組分的染色質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量。本研究對不同部位脂肪的兩個細胞組分的ChIP實驗方法進行了一系列優(yōu)化,以獲得更多更高質(zhì)量的染色質(zhì)。

對象和方法

研究對象選擇12周齡的C57BL/6J雄性小鼠, 用濃度為0.2%～0.5%的一氧化碳對小鼠進行安樂死,隨后使用頸椎脫位確認安樂死,并立即解剖樣品。以75%乙醇對小鼠進行消毒,并確認小鼠表面足夠濕潤,以減少皮毛對解剖的污染。

不同部位脂肪組織的解剖和獲取分離棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT),將小鼠置于俯臥位,用解剖針固定其四肢。然后提起頸部皮膚,沿脊柱至背部中段做垂直切口。剝離皮膚露出肩胛間脂肪庫,剪下蝴蝶形的BAT,去除表面的白色脂肪組織。

分離腹股溝下脂肪組織(inguinal adipose tissue, IAT),將小鼠置于仰臥位并固定四肢。提起胸骨底部的皮膚,從胸骨底部到尾根部做垂直切口。剝離腹、腿部的皮膚,露出與皮膚相連的三角形的IAT并切除。

分離性腺脂肪組織(gonadal adipose tissue, GAT),提起腹膜,從胸骨底部到直腸底部做垂直切口。剝離腹膜后,找到睪丸并用提起GAT,仔細切除脂肪組織,避開睪丸、附睪和血管。

腎周脂肪組織(perirenal adipose tissue, PRAT) 環(huán)繞雙側(cè)腎臟。先將腎臟提起并拉至中線,辨認PRAT與其后方的腹膜后脂肪組織(retroperitoneal adipose tissue, RAT)之間的分界線。切除與腎臟直接相連的脂肪組織,并確保將腎臟上方的腎上腺從脂肪中剔除。

RAT位于脊椎兩旁,沿著腹膜后壁和脊髓之間的邊界分布。在切除PRAT后,使用虹膜剪小心地從腹膜后壁上將其切除。

組織消化解剖完成后將脂肪組織轉(zhuǎn)移至裝有磷酸鹽緩沖冰鹽水(phosphate buffered saline, PBS)的5 mL離心管中,剪成<1 mm的組織塊,再轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,加入適量膠原酶Ⅰ(2 mg/mL)解離緩沖液。組織消化在恒溫37℃搖床(EZ ThermoShake)進行,轉(zhuǎn)速100 r/min,30～40 min,消化至看不見組織顆粒的勻漿狀態(tài)時,加入含10%新鮮胎牛血清的細胞培養(yǎng)基3 mL 終止消化。勻漿過濾后在4℃、500 g的條件下離心8 min。

ChIP-seq實驗按文獻方案進行[18]。Sonics VCX-130用于超聲片段化染色質(zhì),參數(shù)設(shè)置為每個循環(huán)開啟30 s,關(guān)閉30 s,共15次循環(huán)。使用2 μg抗體[組蛋白H3賴氨酸27的乙?；?H3K27ac),Abcam,ab4729;組蛋白H3賴氨酸4的三甲基化(H3K4me3),Abcam,ab8580]進行免疫沉淀。使用DNA Clean & Concentrator-5試劑盒(ZYMO)進行純化 DNA。使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (E7370)為ChIP樣品構(gòu)建文庫,并由安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司在HiSeq4000上進行測序。

ChIP-seq的分析流程每個樣本獲得的數(shù)據(jù),使用cutadapt[19]1.18 版本去接頭,并使用參數(shù)“--no-mixed”和“--no-discordant”與 bowtie2[20]2.3.0版本與參考序列進行比對。SAMtools[21]1.3.1 版本、Picard 中的MarkDuplicates和 bedtools 2.25.0 版本用于去除比對后數(shù)據(jù)中的重復(fù)。 MACS2[22]2.1.2 版用于基因組范圍的結(jié)合峰尋找,參數(shù)“--broad”專門用于 H3K27ac 的峰。bedGraphToBigWig4.0版本用于將bedGraph文件轉(zhuǎn)換為BigWig文件。

統(tǒng)計學(xué)方法采用《R軟件4.0.3》進行數(shù)據(jù)計算。成熟脂肪細胞、SVF細胞優(yōu)化前后DNA含量的比較采用配對t檢驗。ChIP-seq數(shù)據(jù)優(yōu)化前后峰的個數(shù)和FRIP分數(shù)的比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

各部位脂肪組織的解剖順序獲取新鮮的組織或細胞是ChIP實驗的第一步。因此必須快速進行解剖以保持染色質(zhì)的完整性。我們按照BAT、IAT、GAT、PRAT和RAT的順序解剖了小鼠的脂肪庫(圖1A),5min左右即可完成一只小鼠的五次解剖,至少節(jié)省50%時間。

SVF細胞分離方法的優(yōu)化經(jīng)過解剖、消化和離心的步驟后,獲得了含有新鮮脂肪組分的三層溶液。頂層含有成熟脂肪細胞,中間層是解離緩沖液,底部沉淀含有SVF細胞(圖1B)。為了分離成熟脂肪細胞和SVF細胞,需要將三層分離開來。通常的做法是,將頂層成熟脂肪細胞用移液槍轉(zhuǎn)移到新的離心管中,丟棄中間層,隨后將底部的SVF細胞重懸并留置在管中。按照上述實驗方法,轉(zhuǎn)移脂肪層后大量的油脂牢固地附著在管壁上,在固定過程中油脂將與SVF細胞混合并牢固地附著在其細胞膜上(圖1C)。在超聲裂解染色質(zhì)的過程中,附著在細胞膜表面的油脂會重新釋放到緩沖液中,干擾超聲效率,SVF細胞的染色質(zhì)片段會變得過長或過短,同時因為背景噪聲高導(dǎo)致ChIP結(jié)果不佳。

為了避免出現(xiàn)上述問題,本研究優(yōu)化了SVF細胞的分離。去除頂層和中間層后,先用200 μL PBS快速重懸管底的SVF細胞,然后迅速轉(zhuǎn)移到新的離心管中,避免從離心管壁中帶出任何油脂(圖1C)。該轉(zhuǎn)移步驟的添加顯著減少了油脂污染。超聲處理后含有染色質(zhì)片段的緩沖液不再被油脂污染,變得清晰透明(圖1D)。 DNA片段大小大致正常分布,長度為200～500 bp,適合后續(xù)高通量測序(圖1E)。

圖1 防止SVF細胞被油脂污染的實驗方法的優(yōu)化BAT:棕色脂肪組織;IAT:腹股溝下脂肪組織;GAT:性腺脂肪組織;PRAT:腎周脂肪組織;RAT:腹膜后脂肪組織;SVF:血管基質(zhì)組分;BP:堿基對;橫軸:片段的大小;縱軸:熒光定量;A:按① BAT ② IAT ③ GAT ④ PRAT ⑤ RAT 的順序進行解剖;B:離心后分層,從上到下依次為成熟脂肪細胞、解離緩沖液和SVF細胞;C:優(yōu)化前:由于油脂牢固地附著在管壁上,SVF細胞在后續(xù)操作中會受到污染;優(yōu)化后:使用小體積重懸進行額外的轉(zhuǎn)移來避免油脂污染;D:優(yōu)化前:被油脂污染的染色質(zhì)溶液呈白色混濁;優(yōu)化后:獲得的染色質(zhì)溶液清晰透明,無油脂污染;E:優(yōu)化實驗方法中獲得的DNA片段的大小分布;此結(jié)果是使用LabChip Touch獲得的

增加成熟脂肪細胞染色質(zhì)數(shù)量方法的優(yōu)化獲得成熟脂肪細胞后,繼續(xù)進行固定和洗滌。原始實驗方法中,每次進行離心后,都是使用移液槍直接將漂浮在頂部的成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)移到新的離心管中(圖2A)。由于成熟脂肪細胞的低表面張力和高黏度,細胞傾向于留在緩沖液中或黏在管壁和移液槍吸頭上,在轉(zhuǎn)移過程中細胞損失很高。

為了減少細胞損失,本研究選擇抽出下層緩沖液,將成熟脂肪細胞留在原離心管中,不進行轉(zhuǎn)移。由于成熟的脂肪細胞會黏附在移液槍吸頭上,改用5 mL注射器來進一步防止細胞損失(圖2B)。在原管中進行固定和三次洗滌,直到細胞溶解。通過這些優(yōu)化步驟,可以獲得更多的成熟脂肪細胞,其DNA獲得量的增長率為117.2%～150.0%(圖2C,表1)。

提高SVF細胞染色質(zhì)回收率方法的優(yōu)化除了成熟脂肪細胞,本研究還嘗試提高 SVF細胞染色質(zhì)的回收率。在原始方案中,在獲得SVF細胞后通常對SVF組分進行紅細胞裂解的操作,可能對其他細胞類型造成潛在傷害。由于成熟的紅細胞沒有細胞核,本研究直接省略紅細胞裂解步驟。改進后觀察發(fā)現(xiàn),SVF細胞的染色質(zhì)回收率顯著增加,其DNA獲得量的增長率為54.8%～223.7%(圖2D,表1)。

圖2 增加成熟脂肪細胞和SVF細胞的染色質(zhì)數(shù)量DNA:脫氧核糖核酸;SVF:血管基質(zhì)組分;H3K27ac:組蛋白H3賴氨酸27的乙?；?H3K4me3:組蛋白H3賴氨酸4的三甲基化。A:成熟脂肪細胞的原始轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)致細胞大量損失;B:優(yōu)化的實驗方法將使成熟脂肪細胞的數(shù)量增加到兩倍以上;C:成熟脂肪細胞ChIP-DNA條形圖;D:SVF細胞ChIP-DNA條形圖;*:與優(yōu)化前比較,P<0.05

表1 實驗方法優(yōu)化前后的樣品和ChIP-DNA的相關(guān)信息

代表性結(jié)果通過優(yōu)化的實驗方法,對制備完成的ChIP庫進行測序和分析。結(jié)果顯示在SVF細胞標記基因座 Pecam1、Cd34和Cd14以及在脂肪細胞標記基因座Dock6、Pck1和Adipoq的顯著 H3K27ac信號(圖3A)。使用優(yōu)化的實驗方法檢測到更多高質(zhì)量的峰和更高的峰讀數(shù)(FRIP)分數(shù)(圖3B)。對于成年雄性小鼠PRAT的成熟脂肪細胞,使用優(yōu)化的實驗方案確定了29 282個高置信度峰,其中 46.02%的峰位于啟動子中,24.48%位于內(nèi)含子中,19.29% 位于遠端基因間區(qū)域。對于SVF細胞,使用優(yōu)化的實驗方案確定了27 203個高置信度峰,其中 47.61%的區(qū)域位于啟動子中,25.49%位于內(nèi)含子中,17.48%位于遠端基因間區(qū)域(圖 3C)。這些結(jié)果表明,對脂肪組分的ChIP優(yōu)化方案是有效的,實驗方法同樣適用于體積重量有限的脂肪庫。

圖3 優(yōu)化實驗方案后獲得的組蛋白圖譜SVF:血管基質(zhì)組分;UTR:非翻譯區(qū);A:從SVF細胞(左)和成熟脂肪細胞(右)的 H3K27ac 的ChIP-seq數(shù)據(jù)生成的標準化bigwig格式文件。Pecam1、Cd34、Cd14(SVF細胞的標記基因)、Dock6、Pck1 和Adipoq(脂肪細胞的標記基因)基因座的基因組瀏覽器視圖;B:ChIP-seq數(shù)據(jù)的峰的個數(shù)和FRIP分數(shù)的條形圖;條形圖表示2次重復(fù)的樣本平均值;與優(yōu)化前比較,*P<0.05,**P<0.01;C:成熟脂肪細胞和SVF細胞的H3K27ac的ChIP-seq峰的全基因組分布

討 論

獲得高質(zhì)量染色質(zhì)是ChIP-seq面臨的挑戰(zhàn)之一。本文優(yōu)化了從脂肪組分中制備ChIP實驗所需染色質(zhì)實驗方案,減少了脂肪細胞損失,可防止油脂污染并提高體積重量有限的脂肪組分中染色質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量。

使用優(yōu)化的實驗方法,我們從4只小鼠的5個脂肪庫中獲得了ChIP實驗所需的足夠的染色質(zhì),并獲得了高質(zhì)量的成熟脂肪細胞和SVF細胞組蛋白修飾圖譜。與已發(fā)表的文獻相比,在將每一只小鼠作為一個獨立樣本進行研究的前提下,研究者更傾向選用GAT這種含量豐富的脂肪組織作為研究材料[16-17],而本實驗方法對體積重量有限的脂肪組織尤其奏效。例如,與肥胖相關(guān)的BAT在每只成年雄性小鼠體內(nèi)僅有0.15g[23];在解剖中發(fā)現(xiàn),與腎臟疾病相關(guān)的PRAT數(shù)量更少,一般每只成年雄性小鼠體內(nèi)僅有0.1g左右。然而本文通過優(yōu)化的實驗方法,成功地對BAT和PRAT組分進行ChIP-seq,以進一步了解其在肥胖和其他相關(guān)疾病中的作用。同樣,本實驗方法也可用于有限的體內(nèi)脂肪組織細胞組分的研究,不使用體外生長的誘導(dǎo)細胞系。因此,本結(jié)果為研究珍貴的稀有脂肪組分的表觀遺傳學(xué)提供了更好的選擇。

在富含油脂的組織或細胞類型的ChIP實驗中,防止細胞被油脂污染同樣重要。除了脂肪組織,來自肥胖動物的其他組織,如肝臟含有的大量油脂,可能會干擾后續(xù)實驗。通過本文優(yōu)化的實驗方法,可以獲得沒有油脂污染的高質(zhì)量染色質(zhì),并得到高信噪比的表觀遺傳圖譜以供進一步研究。

總之,本研究優(yōu)化了ChIP實驗方法,可以更好地對體積重量有限和富含油脂的脂肪組分進行表觀遺傳學(xué)研究,為后續(xù)研究脂肪組織相關(guān)疾病如肥胖、糖尿病腎病等提供了可行的實驗方案。