硼對(duì)皖西白鵝產(chǎn)蛋期下丘腦中GRB2、HSP70和AMPK基因表達(dá)的影響

趙春芳，陳 寧，張 路，楊同生，趙香帥，韓玉皎，任 曼，靳二輝，2，胡倩倩，李升和

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.安徽安豐堂動(dòng)物藥業(yè)有限公司，安徽 廬江 231521)

鵝是我國(guó)最早飼養(yǎng)的水禽之一，鵝喜水，合群性好，較耐寒，易于養(yǎng)殖，在整個(gè)中國(guó)分布廣泛。鵝的品種也是十分豐富，根據(jù)《中國(guó)畜禽遺傳資源志?家禽志》記載，我國(guó)有30個(gè)地方家鵝品種。鵝具有多種經(jīng)濟(jì)用途，可生產(chǎn)鵝肉、鵝蛋、鵝絨和鵝肝，但鵝的繁殖受制于季節(jié)，不能達(dá)到經(jīng)濟(jì)效益最大化。影響繁殖的主要因素是母鵝會(huì)表現(xiàn)出季節(jié)性就巢，就巢就是人們所說(shuō)的“抱窩”，是禽類產(chǎn)蛋后特有的行為。母鵝就巢時(shí)會(huì)停止下蛋，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)許多特殊的生理行為，比如采食減少，單獨(dú)行動(dòng)，毛色無(wú)光澤，護(hù)窩性明顯增強(qiáng)，不同地區(qū)的鵝會(huì)表現(xiàn)出不同的就巢性。長(zhǎng)時(shí)間的就巢會(huì)對(duì)鵝的生長(zhǎng)發(fā)育以及下一個(gè)產(chǎn)蛋期帶來(lái)負(fù)擔(dān)[1]。

皖西白鵝是安徽省優(yōu)良的地方品種，抗病力強(qiáng)、耐粗飼、耗料少，但是產(chǎn)蛋期短、就巢性強(qiáng)，低產(chǎn)性能嚴(yán)重影響其推廣繁育。目前已有多位學(xué)者分析不同鵝品種、不同產(chǎn)蛋階段下丘腦、垂體和卵巢中基因的表達(dá)差異，篩選出許多候選基因[2，3]。

硼是一種具有生物活性的微量元素，人體可以從水果、蔬菜、豆類、堅(jiān)果和飲用水中獲得這種元素，它還被廣泛用于醫(yī)療保健、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和化妝品行業(yè)中[4-6]。硼顯示出多種作用，在骨骼發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞膜的完整性和功能、礦物質(zhì)的代謝、免疫調(diào)節(jié)和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮各種作用[7-11]。

我們?cè)陲暳现刑砑硬煌瑵舛鹊呐鹚幔治雠饘?duì)皖西白鵝生長(zhǎng)和繁殖性能相關(guān)基因表達(dá)的影響。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，禽類的就巢可能與一些環(huán)境因素和飼養(yǎng)環(huán)境因素有關(guān)，當(dāng)鵝受到這些因素刺激時(shí)，就有可能導(dǎo)致就巢相關(guān)基因表達(dá)水平的改變從而出現(xiàn)就巢情況[1]。本試驗(yàn)基于前期研究成果，選取3個(gè)候選基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，分別是生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)、熱休克蛋白70(HSP70)和磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，分析這三個(gè)基因在皖西白鵝產(chǎn)蛋期中不同硼添加水平下的差異表達(dá)。表達(dá)差異顯著的基因?qū)橄乱徊綇姆肿铀窖芯岿Z產(chǎn)蛋性能的潛在機(jī)制，為生產(chǎn)中鵝產(chǎn)蛋性狀的選育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取120只體重相近、健康的一年齡皖西白鵝，隨機(jī)分為三組，其中對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實(shí)驗(yàn)組在飼喂基礎(chǔ)日糧的條件下，分別添加不同比例的硼元素。由于硼元素的添加量需要用于專利申請(qǐng)，具體的添加比例將在專利授權(quán)后公布。實(shí)驗(yàn)周期為60天。屠宰后采集皖西白鵝的下丘腦組織，用DEPC水處理后，儲(chǔ)存于-80 ℃。

1.2 RNA的提取

取出保存在超低溫冰箱的組織，暫時(shí)存放在放有液氮的容器中。用研缽將組織磨成粉末，其間保持研缽內(nèi)有液氮，防止組織中的RNA降解。RNA的提取采用的是Invitrogen公司的Trizol試劑。然后用1.5%的凝膠電泳液檢測(cè)RNA質(zhì)量，質(zhì)量完好的RNA保存于-80 ℃。

1.3 cDNA的制備與檢測(cè)

cDNA的制備采用TransGen公司的EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒試劑，按照試劑的說(shuō)明書操作，將之前制得的RNA解凍，依次加入試劑和RNA溶液，放入PCR儀器中按照反轉(zhuǎn)錄程序制備cDNA。以cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在不同營(yíng)養(yǎng)條件下，皖西白鵝產(chǎn)蛋期下丘腦中GRB2、HSP70和AMPK基因的表達(dá)變化情況，其中GRB2、HSP70、AMPK和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

表1 用于熒光定量PCR的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。利用SPSS 21.0軟件中One-way進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Duncan進(jìn)行多重比較分析。當(dāng)P<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)之間差異顯著；當(dāng)P<0.01時(shí)表示數(shù)據(jù)之間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取的質(zhì)量

經(jīng)純度、濃度檢測(cè)，RNA的質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。在下丘腦樣品中，A260/A280為1.9～2.0。在1.5%凝膠電泳檢測(cè)中，RNA帶形較為清晰，完整性較好，表明RNA沒(méi)有被降解，并且加樣孔中沒(méi)有亮帶，這個(gè)則表明RNA沒(méi)有被污染。RNA條帶清晰，證明RNA沒(méi)有被降解。

圖1 提取的總RNA電泳圖

2.2 熒光定量結(jié)果

2.2.1 GRB2基因在下丘腦中的表達(dá)水平

如圖2所示，與對(duì)照組相比，在基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度的硼都會(huì)使GRB2基因的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。GRB2基因?yàn)樯L(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Ash)，它是由中間結(jié)構(gòu)域SH2和兩側(cè)作為連接臂的SH3結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成，其中SH2可以與部分受體蛋白磷酸化區(qū)域相結(jié)合[12]。GRB2作為一種銜接蛋白，廣泛分布于下丘腦-垂體-卵巢軸，有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及卵泡發(fā)育的功能，能夠參與多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)[13]。據(jù)相關(guān)研究表明，該基因是ERK信號(hào)通路上的重要基因，而該通路與鵝產(chǎn)蛋性能有較大的相關(guān)性。孫永峰等通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)籽鵝的不同等級(jí)卵泡進(jìn)行了分析，結(jié)果表明GRB2的相對(duì)表達(dá)量在不同卵泡中存在明顯的差異[14]。固始雞飼養(yǎng)中利用飲水補(bǔ)硼，結(jié)果顯示100mg/L硼添加量能夠使雞的體重和體增重發(fā)生顯著增加，具有促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的作用[15]。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硼抑制該基因的表達(dá)，關(guān)于硼調(diào)控該基因表達(dá)的參考文獻(xiàn)較少，具體的作用機(jī)制需要進(jìn)一步探索分析。

圖2 下丘腦GRB2基因表達(dá)水平

2.2.2 HSP70基因在下丘腦中的表達(dá)水平

如圖3所示，與對(duì)照組相比，在基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度的硼都會(huì)使HSP70基因的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。熱休克蛋白的表達(dá)與應(yīng)激作用有關(guān)，熱休克蛋白分泌量減少，提示鵝對(duì)環(huán)境的應(yīng)激減少。HSP70是一類非常保守的蛋白質(zhì)，對(duì)于動(dòng)物的應(yīng)激有很強(qiáng)的保護(hù)性，能夠保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激原刺激，提高細(xì)胞的抵抗力，在蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸和組裝的平衡等生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。HSP70在熱應(yīng)激時(shí)被大量的合成和消耗[16]。所有的動(dòng)物都通過(guò)合成HSPs在細(xì)胞水平上對(duì)熱應(yīng)激做出反應(yīng)，這有助于保護(hù)細(xì)胞免受熱誘導(dǎo)的傷害[17]。HSP70可能提高豬的熱耐力。屠云潔(2010)等發(fā)現(xiàn)，在寒冷反應(yīng)中HSP70是鵝下丘腦的一個(gè)上調(diào)轉(zhuǎn)錄本[18]。飼養(yǎng)鴕鳥(niǎo)過(guò)程中在飲水中添加低濃度的硼酸，發(fā)現(xiàn)HSP70蛋白表達(dá)量發(fā)生上調(diào)[19]。本實(shí)驗(yàn)中添加微量元素硼可以使HSP70的表達(dá)量下降，而皖西白鵝產(chǎn)蛋期大多在冬季，推測(cè)硼或許可以增強(qiáng)個(gè)體的抗應(yīng)激能力。

圖3 下丘腦HSP70基因表達(dá)水平

2.2.3 AMPK基因在下丘腦中的表達(dá)水平

如圖4所示，與對(duì)照組相比，在基礎(chǔ)日糧中添加不同濃度的硼都會(huì)使AMPK基因的表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。AMPK和機(jī)體的葡萄糖平衡有關(guān)，它的低表達(dá)會(huì)使鵝的代謝降低。AMPK是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在分子水平上屬于異源三聚體蛋白質(zhì)。該激酶由α、β和γ三種亞單位組成，催化亞基α存在兩種同源異構(gòu)體，β存在兩種調(diào)節(jié)亞基，γ存在三種調(diào)節(jié)亞基，在β亞基C末端存在的保守結(jié)構(gòu)域是形成AMPK三聚體的關(guān)鍵，可以形成12種不同的復(fù)合物[20]。動(dòng)物機(jī)體各個(gè)組織內(nèi)廣泛存在著AMPK的亞單位，表明AMPK有能夠參與許多機(jī)體代謝反應(yīng)的可能。比如骨骼肌中葡萄糖和脂肪代謝就有AMPK的參與，肝臟中AMPK能夠抑制糖異生等[21，22]。下丘腦是調(diào)節(jié)食欲和能量平衡的關(guān)鍵中樞，而AMPK在其中起著重要的作用[23]。最近的一些研究表明，AMPK在下丘腦水平的食欲控制中起著關(guān)鍵作用[24]。AMPK不僅可以通過(guò)介導(dǎo)下丘腦中厭食和饑餓信號(hào)的拮抗作用來(lái)調(diào)節(jié)能量攝入和體重[23]；還可以調(diào)節(jié)下丘腦中轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)以及脂肪酸、膽固醇和葡萄糖代謝中關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)活動(dòng)[25]。有實(shí)驗(yàn)表明禁食可以增加下丘腦區(qū)域的AMPK活性，刺激攝食，而抑制下丘腦AMPK活性則會(huì)導(dǎo)致食欲減退和體重減輕[22，23]。對(duì)產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝下丘腦的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMPK在產(chǎn)蛋期表達(dá)上調(diào)，這可能是產(chǎn)蛋鵝食物攝入量增加的基礎(chǔ)[26]。有趣的是，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加硼會(huì)使AMPK的表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)，而試驗(yàn)組和對(duì)照組中鵝的采食量并未發(fā)生明顯變化(未發(fā)表)，硼元素通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)AMPK基因表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。

圖4 下丘腦AMPK基因表達(dá)水平

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加不同濃度硼酸，皖西白鵝產(chǎn)蛋期下丘腦中AMPK、HSP70和GRB2基因的表達(dá)都會(huì)顯著下調(diào)，表明飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分可影響機(jī)體就巢相關(guān)基因的表達(dá)，下一步將從細(xì)胞水平揭示其具體的調(diào)控機(jī)制。