溫嶺高峰牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性分析

李 雙，夏小婷，李付強(qiáng)，陳寧博，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.湖南南天華實(shí)業(yè)有限公司，湖南 漣源 417126)

我國(guó)黃牛的品種資源十分豐富，有55個(gè)地方黃牛品種資源[1]。55個(gè)地方黃牛品種分布地域廣泛，按地理分布不同，分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類[2]。關(guān)于中國(guó)黃牛的起源問(wèn)題，一直以來(lái)都存在不同的觀點(diǎn)，眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者從Y染色體分子遺傳多態(tài)性及線粒體DNA多態(tài)性方面進(jìn)行系統(tǒng)研究[3-7]，證明北方黃牛主要受普通牛的影響，南方黃牛主要受瘤牛的影響，中原黃牛同時(shí)受到普通牛和瘤牛的影響，表明我國(guó)黃牛為多元起源的，表明中國(guó)黃牛具有普通牛和瘤牛兩大母系起源?？傮w來(lái)看，我國(guó)普通牛和瘤牛血統(tǒng)所占比例在地理分布上呈現(xiàn)明顯的梯度變化趨勢(shì)。

哺乳動(dòng)物的線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)為閉合環(huán)狀雙鏈分子，一般大小為16.5 kb，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遵循母系遺傳、無(wú)重組、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，可以很好地反映家畜的母系起源。與其他哺乳動(dòng)物一樣，牛的線粒體DNA同樣由37個(gè)蛋白編碼基因和一段910 bp的D-loop區(qū)組成[12]。Xia等[6]系統(tǒng)分析了57個(gè)中國(guó)地方黃牛品種/群體共1 105個(gè)個(gè)體的線粒體DNA D-loop區(qū)的遺傳多樣性和母系起源，發(fā)現(xiàn)中國(guó)地方黃牛有普通牛T1a、T2、T3、T4、T5和瘤牛I1、I2共7種單倍型組，單倍型多樣度為0.904±0.008，表明中國(guó)地方黃牛的線粒體遺傳多樣度非常豐富。在普通牛單倍型組中，T2、T3和T4是中國(guó)北方黃牛的主要單倍型組，在瘤牛單倍型組中，I1在中國(guó)南方黃牛中占主導(dǎo)地位，I2只近分布在中國(guó)西南地區(qū)(云貴高原和西藏)和新疆地區(qū)。另外，在西藏牛中檢測(cè)到8個(gè)個(gè)體屬于牦牛線粒體序列，說(shuō)明西藏牛與牦牛存在基因交流。目前有關(guān)黃牛mtDNA全基因組的研究不多。Xia等[7]分析了我國(guó)肉牛培育品種云嶺牛129個(gè)個(gè)體的mtDNA全基因組遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，共檢測(cè)到普通牛T1、T2、T3、T4、T6和瘤牛I1、I2共7種單倍型組，表明云嶺牛擁有豐富的線粒體遺傳多樣性。Xia等[8]分析了170個(gè)蒙古牛系統(tǒng)10個(gè)群體的線粒體基因組，發(fā)現(xiàn)其擁有T1、T2、T3、T4、I、Q、P與牦牛的支系。

溫嶺高峰牛是我國(guó)南方地區(qū)的優(yōu)良地方黃牛品種，具有役力較強(qiáng)、遺傳性穩(wěn)定、適應(yīng)性良好的特點(diǎn)[9]，但隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，溫嶺高峰牛的存欄量越來(lái)越少，并于2001年被農(nóng)業(yè)部列入國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)名錄。同時(shí)溫嶺高峰牛也具有骨骼細(xì)致，肌肉結(jié)實(shí)豐滿的特點(diǎn)，有向役肉兼用方向發(fā)展的良好基礎(chǔ)，因此在做好活畜保種的同時(shí)，也可以開(kāi)展雜交改良工作[10]。本研究對(duì)溫嶺高峰牛的線粒體DNA全基因組多態(tài)性進(jìn)行分析，從母系遺傳的角度鑒定溫嶺高峰牛的群體結(jié)構(gòu)以及遺傳多樣性，為溫嶺高峰牛的保種和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究按照隨機(jī)典型抽樣方法，從浙江省溫嶺高峰牛保種場(chǎng)采集10頭溫嶺高峰牛耳組織樣本，所采集的每個(gè)樣本都符合溫嶺高峰牛的品種特征，并根據(jù)家系信息盡量避開(kāi)個(gè)體間的血緣關(guān)系。從GenBank下載9條溫嶺高峰牛全基因組序列(其登錄號(hào)為：DRR295117-DRR295125)。同時(shí)從GenBank下載7條代表不同單倍型組的線粒體DNA全基因組序列以及1條牦牛線粒體DNA全基因組序列(GenBank號(hào)為：EU177841.1、AY676856.1、EU177839.1、AB074964.1、EU177862.1、EU177868.1、AF492350.1、AY684273.2)作為對(duì)照。

1.2 DNA提取與測(cè)序

用標(biāo)準(zhǔn)苯酚—氯仿法提取溫嶺高峰牛的基因組DNA，將檢測(cè)質(zhì)量良好的DNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司，構(gòu)建長(zhǎng)度為350 bp左右的文庫(kù)，利用Illumina HiSeq 2000 PE150的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

用Trimmomatic軟件去除溫嶺高峰?；蚪M中測(cè)序低質(zhì)量和接頭序列，用BWA-MEM(0.7.13-r1126)軟件將過(guò)濾后質(zhì)量合格的序列比對(duì)到最新參考基因組(ARS-UCD1.2)中的線粒體基因組上(GenBank：AY526085.1)。將BAM比對(duì)轉(zhuǎn)換為FASTQ文件，然后使用Mapping Iterative Assembler v1.0(MIA，https:/github.com/mpieva/mapping-iterative-assembler)組裝溫嶺高峰牛的線粒體DNA基因組全序列。

使用DnaSPv 5.10軟件對(duì)溫嶺高峰牛的線粒體DNA基因組序列進(jìn)行分析，對(duì)溫嶺高峰牛的單倍型和變異位點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異(k)。利用MEGA 5.0對(duì)溫嶺高峰牛的線粒體DNA基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，之后進(jìn)行人為校正，將GenBank上下載的7條具有代表性的線粒體DNA基因組序列(包括單倍型T1、T2、T3、T4、T5、I1、I2)以及1條牦牛線粒體DNA基因組序列作為對(duì)照，構(gòu)建溫嶺高峰牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。最后使用NETWORK 5.0.1.1軟件構(gòu)建溫嶺高峰牛單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫嶺高峰牛線粒體DNA全基因組的序列特征

對(duì)19頭溫嶺高峰牛的線粒體全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其平均比對(duì)率為99.91%，對(duì)比率范圍為99.82%～99.97%；平均深度為861.70 x，深度范圍為(362.25～2 184.86) x。溫嶺高峰牛線粒體DNA全基因組序列由A、T、G、C 4種堿基組成，其中A堿基含量最高(33.5%)，其次為T(27.1%)和C(26.0%)，G堿基含量最低，僅為13.4%。A+T的平均含量為60.6%，G+C的平均含量為39.4%。11頭溫嶺高峰牛線粒體DNA基因組長(zhǎng)度為16 338 bp，7頭溫嶺高峰牛線粒體DNA基因組長(zhǎng)度為16 339 bp，1頭溫嶺高峰牛線粒體DNA基因組長(zhǎng)度為16 340 bp，這種長(zhǎng)度變化主要是插入和缺失導(dǎo)致的。在19頭溫嶺高峰牛群體中共檢測(cè)到263個(gè)變異位點(diǎn)，有258個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)，5個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。258個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)均為兩堿基突變，而5個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)中有4個(gè)為兩堿基突變，1個(gè)為三堿基突變。

2.2 溫嶺高峰牛線粒體DNA全基因組遺傳多樣性和單倍型組成

研究分析了溫嶺高峰牛的線粒體DNA全基因組的序列變異，以評(píng)估其線粒體DNA遺傳變異和母系起源。結(jié)果顯示在19頭溫嶺高峰牛中定義了9種單倍型，其中，有8個(gè)單倍型(共包含18個(gè)體，占94.74%)屬于瘤牛，有1個(gè)單倍型(包含1個(gè)體，占5.36%)屬于普通牛。溫嶺高峰牛單倍型多樣度(Hd±SD)為0.778±0.096，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0017±0.0014，平均核苷酸差異(k)為28.327。

2.3 溫嶺高峰牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA 5.0軟件對(duì)19頭溫嶺高峰牛線粒體DNA基因組序列組成的9個(gè)單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以從GenBank下載的7條具有代表性的線粒體DNA基因組序列(T1、T2、T3、T4、T5、I1、I2)作為參考，以1條牦牛線粒體DNA基因組序列作為外群，構(gòu)建溫嶺高峰牛的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖1可以看出，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹將溫嶺高峰牛分為瘤牛和普通牛兩大支系，8個(gè)瘤牛單倍型(包含18個(gè)體，占94.74%)屬于I1單倍型組，僅有1個(gè)單倍型(包含1個(gè)體，占5.36%)屬于普通牛支系，說(shuō)明溫嶺高峰牛是普通牛與瘤牛的混合母系起源，主要受瘤牛的影響。

2.4 構(gòu)建溫嶺高峰牛單倍型的進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖

進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)(network)是一種可以客觀描述物種內(nèi)不同單倍型間遺傳進(jìn)化關(guān)系的方法，其中media-joining進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)可以快速地進(jìn)行大量單倍型數(shù)據(jù)分析。本研究利用Network軟件，以從GenBank下載的7條具有代表性的線粒體DNA基因組序列(T1、T2、T3、T4、T5、I1、I2)以及1條牦牛線粒體DNA基因組序列作為對(duì)照，構(gòu)建了19頭溫嶺高峰牛線粒體DNA全基因組9個(gè)單倍型間的media-joining進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)。從圖2可以看出，本文分析的19頭溫嶺高峰牛均可劃分到瘤牛和普通牛兩個(gè)大的單倍型類群中，其中，8個(gè)單倍型(包含18個(gè)體，占94.74%)屬于瘤牛支系，僅有1個(gè)單倍型(包含1個(gè)體，占5.36%)屬于普通牛支系，表明溫嶺高峰牛是普通牛與瘤牛的混合母系起源，但受瘤牛影響較大，與NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果一致。

圖1 溫嶺高峰牛線粒體DNA基因組單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

注：圓的面積與單倍型頻率成正比，紅點(diǎn)是中值向量。

3 討 論

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量一個(gè)群體線粒體DNA變異程度的重要指標(biāo)，單倍型多樣度和核苷酸多樣度的值越大，說(shuō)明該群體的遺傳多樣性越高，反之，則說(shuō)明該群體的遺傳多樣性越低。Xia等[7]分析了我國(guó)肉牛培育品種云嶺牛的mtDNA全基因組遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其Hd值為0.964，Pi值為0.007 8。Xia等[8]分析了170個(gè)蒙古牛系統(tǒng)10個(gè)群體的線粒體基因組，發(fā)現(xiàn)其Hd值為0.464～1.000，Pi值為0.000 4～0.009 2。本研究表明溫嶺高峰牛的Hd值為0.778，Pi值為0.001 7，與Xia等[7-8]的研究結(jié)果相比，其mtDNA基因組的遺傳多樣性較低，這可能與其群體數(shù)量大大減少，處于保種狀態(tài)有關(guān)。溫嶺高峰牛為役用品種，隨著農(nóng)村經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，其役用功能大都消失，農(nóng)戶已基本不養(yǎng)殖該品種，導(dǎo)致其群體數(shù)量急劇減少，難以進(jìn)行血統(tǒng)更新，從而導(dǎo)致溫嶺高峰牛遺傳多樣性降低[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在19個(gè)溫嶺高峰牛個(gè)體中，1個(gè)普通牛起源的個(gè)體(1/19，占5.26%)共享1個(gè)單倍型，18個(gè)瘤牛起源的個(gè)體(18/19，占94.74%)共享8個(gè)單倍型，表明溫嶺高峰牛主要受瘤牛的影響。Jia等[11]對(duì)以中國(guó)地方黃牛為主的亞洲六國(guó)黃牛mtDNA D-loop序列的多樣性研究，其中12個(gè)溫嶺高峰牛全部屬于瘤牛I1單倍型組，沒(méi)有普通牛單倍型。Jiang等[12]對(duì)舟山黃牛和溫嶺高峰牛的全基因組研究，發(fā)現(xiàn)溫嶺高峰牛和舟山黃牛類似，以瘤牛為主，有少量普通牛的基因組滲入。從本研究的mtDNA基因組及全基因組研究均表明，溫嶺高峰牛以瘤牛血統(tǒng)為主，含有極少量普通?；蚪M。孫婷等[13]對(duì)吉安黃牛的mtDNA研究，表明南方地區(qū)的吉安黃牛，其母系起源受瘤牛的影響大。而對(duì)郟縣紅牛的mtDNA遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)郟縣紅牛是典型的中原黃牛，同時(shí)受到普通牛和瘤牛的影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)溫嶺高峰牛線粒體DNA遺傳多樣性較低，具有普通牛和瘤牛兩大母系起源，但主要受瘤牛的影響。由于溫嶺高峰牛的遺傳多樣性較低，在保種條件下更容易近親繁殖，因此應(yīng)該特別注意防止其近親繁殖的問(wèn)題，提高保種監(jiān)測(cè)水平，保證其遺傳資源不丟失，品種特性不改變。要將溫嶺高峰牛產(chǎn)業(yè)做大做強(qiáng)，除了保種外，還要想辦法發(fā)掘其有利肉用性狀，加快推進(jìn)品種資源保護(hù)與有序的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，真正做到對(duì)溫嶺高峰牛品種資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用。

4 結(jié) 論

本文共分析了19頭溫嶺高峰牛的線粒體DNA全基因組序列，其中4種堿基的含量分別為：A(33.5%)、T(27.1%)、C(26.0%)、G(13.4%)，A+T的含量明顯高于G+C，表現(xiàn)出了對(duì)堿基的偏好性，這與一般多細(xì)胞動(dòng)物線粒體DNA的顯著特征相符[15]。19頭溫嶺高峰牛的單倍型多樣度(Hd±SD)為0.778±0.096，核苷酸多樣度(Pi±SD)為0.0017±0.0014，平均核苷酸差異(k)為28.327，與Xia等[7-8]的研究結(jié)果相比，其線粒體DNA基因組的遺傳多樣性較低，這可能與溫嶺高峰牛由于役用功能基本消失而導(dǎo)致農(nóng)戶飼養(yǎng)數(shù)量不斷減少，且難以進(jìn)行血統(tǒng)更新有關(guān)，需要相關(guān)部門進(jìn)一步加大保種力度，從多方面對(duì)溫嶺高峰牛這一品種資源進(jìn)行保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用。同時(shí)，在19頭溫嶺高峰牛的線粒體DNA全基因組序列中發(fā)現(xiàn)了263個(gè)變異位點(diǎn)，共定義9種單倍型，從NJ系統(tǒng)發(fā)育樹以及進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖均可以看出，有8個(gè)單倍型(共包含18個(gè)體，占94.74%)屬于瘤牛支系且均為I1支系，僅有1個(gè)單倍型(包含1個(gè)體，占5.36%)屬于普通牛支系，因此溫嶺高峰牛具有瘤牛和普通牛兩大母系起源，但受瘤牛影響更大。