鄰香蘭素對黃曲霉生長的抑制作用研究

趙 穎，李 倩，朱曉嫚，謝巖黎

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

黃曲霉屬真菌門、半知菌亞門，是一種常見腐生真菌，多見于發(fā)霉的糧食、糧食制品及其他霉腐的有機(jī)物。作為一種致病真菌，黃曲霉的危害主要包括：黃曲霉菌侵染人畜，導(dǎo)致曲霉病；黃曲霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素(AFT)具有強(qiáng)毒性和強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重危害人體健康，污染糧食作物[1]。黃曲霉毒素超標(biāo)導(dǎo)致的糧油產(chǎn)品安全事件時(shí)有發(fā)生[2]。楊博磊等[3]對湖北黃岡花生的污染情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后其黃曲霉毒素B1(AFB1)檢出率為57%，超標(biāo)率為10%。陳麗媛[4]對2018年1—6月飼料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)AFB1檢出率為100%，其中最高值為79.55 μg/kg。鑒于黃曲霉及其毒素的嚴(yán)重危害，防霉控霉在我國糧食加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過程中極為重要。

對于黃曲霉的防控，目前有效的措施有：微波、輻射、光調(diào)控抑菌等物理方法[5]，使用合成化學(xué)防霉劑如富馬酸二甲酯、丙酸、鹽類、苯甲酸等化學(xué)方法[6]，篩選抗黃曲霉的微生物及其代謝產(chǎn)物等生物方法[7-8]。植物天然產(chǎn)物具有抑菌活性的有檸檬醛、肉桂醛等[9-11]，具有安全可靠、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具備被開發(fā)為天然抑菌劑的潛力[12]，是抑菌研究的熱點(diǎn)之一。

香蘭素及其衍生物具有顯著的抑菌活性[13]，其中，鄰香蘭素的研究取得了初步的成果。鄰香蘭素(2-羥基-3-甲氧基苯甲醛)廣泛存在于紅松果[14]和臘菊屬[15]等植物的提取物中。在抑菌方面，鄰香蘭素對煙曲霉、土曲霉、黃曲霉、擴(kuò)展青霉和新生隱球菌均具有抑菌作用，最小抑菌濃度(MIC)分別為76、76、152、152[16]和4 μg/mL[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)鄰香蘭素對黃曲霉的MIC為100 μg/mL[13]，本研究將進(jìn)一步探索鄰香蘭素對黃曲霉發(fā)揮抑制作用的方式并評(píng)估其在食品中的抑菌效果，以期為未來天然抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃曲霉菌株3.6304：中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；鄰香蘭素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶于99%的無水乙醇，配制好的鄰香蘭素稀釋液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱；大米：黑龍江五常京貢米糧食品有限公司；葵花子：市售。

將真菌在沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA：4%葡萄糖、2%瓊脂和1%蛋白胨)上于(28±2) ℃培養(yǎng)1周待用。在沙氏培養(yǎng)基(SDB：4%葡萄糖和1%蛋白胨)中培養(yǎng)用于試驗(yàn)的菌絲體。試驗(yàn)用水為一級(jí)超純水，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；PYX-DHS-40X50-BS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；THZ-92B型氣浴恒溫?fù)u床：上海誦誠實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；BM-37XBC型倒置生物顯微鏡：上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；DFC 7000 T型正置熒光顯微鏡：德國徠卡；UV-6100 S型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；DZS-706-C型多參數(shù)分析儀：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對鄰香蘭素作用下孢子萌發(fā)情況的觀察

1.3.1.1 孢子懸浮液制備

取黃曲霉生長1周左右的培養(yǎng)皿，倒入適量無菌生理鹽水，并用涂布器均勻涂布培養(yǎng)基表面，隨后用濾紙過濾，所得濾液即為孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，通過計(jì)算，調(diào)整孢子密度為5×105個(gè)/mL。

1.3.1.2 鄰香蘭素對孢子萌發(fā)的影響

向所得孢子懸浮液中加入鄰香蘭素稀釋液，濃度梯度選取參照Li等[13]的方法。隨后靜置于恒溫培養(yǎng)箱(28±2) ℃培養(yǎng)6 h。用槍頭吸取適量懸浮液于載玻片，在油鏡下觀察不同質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理下孢子形態(tài)差異。

1.3.2 鄰香蘭素對黃曲霉孢子呼吸代謝影響的測定

鄰香蘭素對黃曲霉孢子呼吸代謝影響的測定參考Li等[18]的方法。

1.3.3 鄰香蘭素對黃曲霉菌絲細(xì)胞膜的影響

1.3.3.1 細(xì)胞膜完整性試驗(yàn)

參考Ouyang等[19]的方法。取50 μL(5×105個(gè)/mL)新鮮配制的黃曲霉孢子懸浮液于10 mL SDB中，置于恒溫培養(yǎng)箱(28±2) ℃培養(yǎng)24 h。加入鄰香蘭素使其終質(zhì)量濃度達(dá)到25、50、100 μg/mL，未加鄰香蘭素的為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)0、4、8、12 h后，取少量菌絲樣品滴在載玻片上，PBS沖洗兩遍，加入一滴PI染料(1 μL/mL，索萊寶生物科技有限公司)，避光靜置20 min，再次用PBS沖洗兩遍，滴加抗熒光淬滅劑(上海生工生物工程有限公司)，然后于熒光顯微鏡下觀察并對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。

1.3.3.2 細(xì)胞核酸釋放含量的測定

參考周海恩[20]的方法。不同質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理0、4、8、12 h后，取2 mL混合物于8 000g離心10 min，取上清液于260 nm處測吸光值。SDB校準(zhǔn)空白。

1.3.3.3 相對電導(dǎo)率和胞外pH值的測定

參考Gao等[21]的方法。依次測定加入鄰香蘭素4、8、12 h后不同質(zhì)量濃度組的菌絲電導(dǎo)率和pH值。最后，將上述菌絲沸水浴5 min，冷卻至室溫后測定最終電導(dǎo)率。根據(jù)以下公式計(jì)算相對電導(dǎo)率。

式中：C1和C2分別代表樣品沸騰前后的電導(dǎo)率；Cw1、Cw2分別代表純水沸騰前后的電導(dǎo)率。

1.3.4 鄰香蘭素的體外抑菌作用

1.3.4.1 對儲(chǔ)存大米中黃曲霉的抑制作用

鄰香蘭素對儲(chǔ)存大米中黃曲霉的抑制試驗(yàn)參考Tang等[22]的方法并稍加修改。試驗(yàn)所用大米預(yù)先用1%次氯酸鈉溶液滅菌30 min，無菌水沖洗3～5次，于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干，并紫外照射30 min。稱取2 g左右預(yù)處理過的大米，規(guī)范放置于培養(yǎng)皿(d=3.5 cm)中。將新鮮的黃曲霉孢子懸浮液(5×105個(gè)/ mL)與鄰香蘭素以0、25、50、100 μg/mL的終質(zhì)量濃度均勻混合。取20 μL上述孢子-鄰香蘭素混合物，與大米混合均勻。用封口膜對培養(yǎng)皿封口，然后置于恒溫培養(yǎng)箱(28±2) ℃中，拍照記錄培養(yǎng)24、48、72 h大米表面黃曲霉菌的生長情況。

1.3.4.2 對葵花子中黃曲霉的抑制作用

鄰香蘭素對儲(chǔ)存葵花子中黃曲霉的抑制試驗(yàn)參考1.3.4.1。污染率指受黃曲霉污染的葵花子粒數(shù)占全部葵花子粒數(shù)的百分率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0、Origin 2017和ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，所用試驗(yàn)至少進(jìn)行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過鄧肯多重檢驗(yàn)確定組間的顯著差異，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰香蘭素作用下孢子萌發(fā)情況分析

已知黃曲霉孢子的正常萌發(fā)時(shí)間為6 h，圖1清晰展示對照組(無鄰香蘭素處理)黃曲霉孢子體積明顯膨大(虛線圈)，并且以此結(jié)構(gòu)為起點(diǎn)(黑色箭頭)，從一端開始延伸，并且有彎曲結(jié)構(gòu)出現(xiàn)(彎曲箭頭)，形成早期菌絲體。菌絲體中不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)隱約可見。不同質(zhì)量濃度的鄰香蘭素處理組均未發(fā)現(xiàn)孢子萌發(fā)，依舊是球形的孢子。孢子表面具有疏水性，當(dāng)孢子僅由于重力作用不均勻沉降在培養(yǎng)皿表面，并未發(fā)生實(shí)質(zhì)黏附，因此，孢子邊緣具亮圈?？傊驹囼?yàn)從形態(tài)學(xué)上展示了早期孢子的萌發(fā)，證實(shí)了鄰香蘭素對孢子萌發(fā)的抑制作用。

注：圖中觀察倍數(shù)相同，只標(biāo)注于其中之一圖中。圖3同。

2.2 鄰香蘭素作用下孢子呼吸代謝的變化

由圖2可知，未加鄰香蘭素的對照組在培養(yǎng)期內(nèi)，其溶解氧含量在6.25～6.72 mg·L-1范圍內(nèi)波動(dòng)，而25、50、100 μg/mL 3個(gè)處理組的溶解氧含量在5.72～6.89 mg·L-1范圍內(nèi)波動(dòng)。由此可見，無論鄰香蘭素質(zhì)量濃度高低，在12 h的作用時(shí)間以內(nèi)，黃曲霉孢子外的溶解氧含量均保持穩(wěn)定，這表明鄰香蘭素處理的黃曲霉孢子在呼吸作用中消耗氧氣量并無顯著變化。延長鄰香蘭素的作用時(shí)間是否會(huì)抑制甚至破壞呼吸作用有待進(jìn)一步的研究。

圖2 鄰香蘭素對黃曲霉孢子氧氣消耗量的影響

2.3 鄰香蘭素作用下黃曲霉菌絲細(xì)胞膜的變化

2.3.1 鄰香蘭素對黃曲霉菌絲細(xì)胞膜完整性的影響

PI染色結(jié)果如圖3a所示，用鄰香蘭素處理的菌絲體發(fā)射紅色熒光，并且隨著鄰香蘭素質(zhì)量濃度和處理時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度增加。由圖3b可知，在12 h內(nèi)，對照組菌絲熒光強(qiáng)度基本沒有變化，均接近0。當(dāng)鄰香蘭素的質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，PI熒光強(qiáng)度開始增強(qiáng)，4、8、12 h時(shí)分別是0 h的2.36、4.46、5.01倍。當(dāng)鄰香蘭素的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，4、8 h時(shí)的熒光強(qiáng)度與25 μg/mL時(shí)的接近，12 h時(shí)則明顯增高，為0 h時(shí)的9.42倍。當(dāng)鄰香蘭素的質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，PI熒光強(qiáng)度則在8、12 h時(shí)顯著變化，依次增高了12.82%和20.00%，說明鄰香蘭素破壞菌絲細(xì)胞膜完整性，且這種破壞作用在50 μg/mL 處理12 h和100 μg/mL 處理8 h時(shí)開始顯著增強(qiáng) (P< 0.05)。在Li等[23]的研究中，鄰香蘭素處理24 h之后，黃曲霉菌絲細(xì)胞膜仍遭受明顯損傷，且這種損傷在MIC時(shí)尤為顯著。以上結(jié)果說明鄰香蘭素對黃曲霉細(xì)胞膜存在持續(xù)的破壞作用。

注：不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)。表1同。

2.3.2 鄰香蘭素作用下黃曲霉菌絲細(xì)胞核酸的釋放

由表1可知，在鄰香蘭素不同質(zhì)量濃度下，0、25 μg/mL時(shí) OD260在處理12 h內(nèi)的變化并不顯著，當(dāng)鄰香蘭素的質(zhì)量濃度不低于50 μg/mL時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長吸光值呈現(xiàn)顯著升高的趨勢。與0 h相比，在處理時(shí)間為4、8、12 h時(shí)，50 μg/mL質(zhì)量濃度組的吸光值依次增加了3.23%、9.68%、19.35%，100 μg/mL質(zhì)量濃度組的吸光值依次增加了74.19%、90.32%、100.00%。結(jié)果表明，在鄰香蘭素的作用下，核酸滲出了完整性受損的細(xì)胞膜。

表1 鄰香蘭素對黃曲霉菌絲細(xì)胞核酸釋放的影響

2.3.3 鄰香蘭素作用下黃曲霉菌相對電導(dǎo)率和胞外pH值的變化

如圖4a所示，0 h時(shí)，對照組和鄰香蘭素處理組的胞外相對電導(dǎo)率在7.37～7.96范圍內(nèi)。正常的黃曲霉菌絲胞外的相對電導(dǎo)率有輕微的升高，這是細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差導(dǎo)致的，鄰香蘭素處理顯著提高了胞外相對電導(dǎo)率。當(dāng)質(zhì)量濃度為25、50 μg/mL時(shí)，4、8、12 h的相對電導(dǎo)率分別為8.50%、11.19%、11.81%和9.25%、11.65%、12.19%。經(jīng)比較，同樣的處理時(shí)間時(shí)，兩質(zhì)量濃度組相對電導(dǎo)率接近。100 μg/mL的鄰香蘭素處理組相對電導(dǎo)率發(fā)生了更顯著的升高，4、8、12 h依次增加了28.83%、30.92%、44.24%。結(jié)果表明，鄰香蘭素對黃曲霉細(xì)胞膜的破壞作用呈現(xiàn)質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。由圖4b可知，對照組在培養(yǎng)24 h后呈現(xiàn)中性，pH值約7.58，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，pH值逐漸降低到約6.22，然后到12 h時(shí)趨于穩(wěn)定，表明細(xì)胞分泌了更多的酸性物質(zhì)。對于鄰香蘭素處理組，隨著處理時(shí)間的延長，pH值也呈現(xiàn)降低的趨勢，且相同的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，pH值較對照組更低，表明鄰香蘭素的處理使更多的酸性物質(zhì)滲出。綜上所述，相對電導(dǎo)率和胞外pH值的變化說明鄰香蘭素破壞了黃曲霉菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致膜通透性增加，從而造成離子泄露、酸性物質(zhì)滲出。

圖4 鄰香蘭素對黃曲霉菌絲相對電導(dǎo)率和胞外pH值的影響

2.4 鄰香蘭素的體外抑菌作用

2.4.1 鄰香蘭素對儲(chǔ)存大米的抑菌作用

如圖5所示，對照組大米在48 h時(shí)呈現(xiàn)輕微黃綠色，72 h時(shí)黃曲霉菌繼續(xù)增長，污染顏色加深，污染表面積增大。與對照組相比，25 μg/mL質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理后，大米在48 h時(shí)出現(xiàn)極少量白色菌絲，72 h時(shí)白色菌絲幾乎鋪滿表面，且少量菌絲開始呈現(xiàn)黃綠色。50 μg/mL質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理后，僅在72 h時(shí)觀察到大米表面極少量的黃曲霉污染。100 μg/mL質(zhì)量濃度的鄰香蘭素處理72 h內(nèi)，大米未被黃曲霉污染。這說明鄰香蘭素在72 h內(nèi)、100 μg/mL時(shí)能夠有效抑制黃曲霉對大米的侵染。

圖5 黃曲霉在鄰香蘭素處理前后大米表面的生長情況

2.4.2 鄰香蘭素對葵花子的抑菌作用

如圖6所示，對照組葵花子在24 h時(shí)無污染跡象，在48 h時(shí)葵花子表面出現(xiàn)白色菌絲，72 h時(shí)黃曲霉繼續(xù)侵染，此時(shí)黃綠色的菌絲完全包裹葵花子。與對照組相比，25 μg/mL質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理后，葵花子在48 h時(shí)開始出現(xiàn)少許白色菌絲，72 h時(shí)菌絲顏色加深，呈黃綠色；50 μg/mL質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理后，48 h時(shí)黃曲霉生長形態(tài)與同時(shí)間25 μg/mL質(zhì)量濃度組相似，但72 h時(shí)黃曲霉大多仍處于白色菌絲狀態(tài)。100 μg/mL質(zhì)量濃度鄰香蘭素處理72 h，葵花子均未被黃曲霉污染。污染率定量結(jié)果表明，24 h時(shí)，對照組和鄰香蘭素處理組的污染率均為0，48 h時(shí)，對照組和鄰香蘭素處理組的污染率為100%、100%、95%、0。72 h時(shí)，僅100 μg/mL組污染率為0，其他均為100%。這說明鄰香蘭素在72 h內(nèi)、100 μg/mL時(shí)能夠有效防控黃曲霉對葵花子的侵染。

圖6 鄰香蘭素處理前后黃曲霉在葵花子表面的生長情況

3 結(jié)論

作為一種天然產(chǎn)物，鄰香蘭素被廣泛應(yīng)用于食品和制藥，但對其抑菌機(jī)制研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，鄰香蘭素處理12 h能夠顯著抑制黃曲霉孢子萌發(fā)和破壞菌絲細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲出，抑制黃曲霉增殖，但對呼吸作用影響很小。此外，鄰香蘭素能夠有效抑制黃曲霉對大米和葵花子的侵染，該結(jié)論具有實(shí)際意義，可進(jìn)一步將鄰香蘭素作為一種天然抑菌劑拓展至糧食及農(nóng)產(chǎn)品的防霉控霉領(lǐng)域。