熒光分光光度法測定海捕魚中石油烴含量

龍 舉，曾軍杰，梅光明

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江舟山 316021)

近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國對石油的進(jìn)口量也逐年遞增[1]，進(jìn)而大型油船事故也隨之增加[2]。2018 年1 月6 日，巴拿馬籍油船“桑吉”輪與香港籍散貨船“長峰水晶”輪在東海海域發(fā)生碰撞，導(dǎo)致“桑吉”輪全船失火，13.6 萬t 船載石油進(jìn)入海洋中[3]。油船事故的發(fā)生無疑會對海洋生態(tài)環(huán)境造成不可估量的巨大損害[4]，石油烴(petroleum hydrocarbon)則已成為我國海域海洋污染因子中最主要的物質(zhì)之一[5]，尤其是石油烴中芳香烴類物質(zhì)會對海洋生物的成長造成巨大的危害[6]。石油烴在海洋中能被膠體顆粒物和懸浮顆粒物所吸附[7]，再通過海洋生物的體膚滲透以及呼吸代謝后蓄積在生物體內(nèi)，一方面導(dǎo)致海洋生物體型變化直至畸形[8]，另一方面海洋生物的生長繁殖也會受影響[9]。海洋生物通過生物富集作用吸收了水體中的石油烴后[10]，通過眾多常見海捕魚直接影響著人類的食品安全[11]。因此，大批量準(zhǔn)確快速測定海捕魚中石油烴含量能及時提供科學(xué)可靠的監(jiān)測數(shù)據(jù)，對保障人們食品安全方面具有重大意義?，F(xiàn)行的檢測石油烴的方法相對較為成熟，其主要有紫外分光光度法[12]、紅外光度法[13]、重量法[14]、熒光分光光度法[15]、液相色譜法[16]以及氣相色譜法[17]等。本實(shí)驗基于《GB 17378.6-2007 國家海洋監(jiān)測規(guī)范(第六部分:生物體分析)》[18]，對樣品前處理操作過程、時間選擇、試劑使用量等進(jìn)行了合理分配，操作上去繁就簡、合理規(guī)范，大大縮短了樣品處理的時間。利用三維相關(guān)光譜技術(shù)分析了熒光條件Ex/Em=230/280 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 時石油烴熒光強(qiáng)度及加標(biāo)回收率。通過本研究，得到結(jié)果準(zhǔn)確、能滿足海捕魚中石油烴大批量檢測的方法，并歸納總結(jié)了海捕魚中石油烴測定實(shí)驗須注意的一些問題。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料與儀器設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗材料

實(shí)驗樣品均為海捕魚類，清水洗凈后取海捕魚可食肌肉部分用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻，-18 ℃冷凍保存。

試驗用水為Milli-Q 超純水；氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇，優(yōu)級純；石油醚(沸點(diǎn)范圍60～90 ℃)，分析純；二氯甲烷，色譜純；

6 mol·L-1氫氧化鈉溶液:準(zhǔn)確稱取240 g 氫氧化鈉，加水溶解并定容到1 000 mL(按需要可同比例增加或減少)冷卻至室溫備用；

飽和氯化鈉溶液:用40 ℃溫水配制飽和氯化鈉溶液，待冷卻至室溫后形成過飽和氯化鈉溶液備用；

脫芳石油醚:石油醚經(jīng)60 目活性炭層析柱約每分鐘60～100 滴流速過柱處理后收集備用；石油類標(biāo)準(zhǔn)溶液:濃度:1 000 mg·L-1(±3%)，購于國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心；原始編號:GBW(E) 080913；有效期:室溫保存3 個月。

石油類標(biāo)準(zhǔn)使用液:取石油類標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 mL 于50.0 mL 棕色容量瓶中用石油醚稀釋并定容至刻度得100.0 mg·L-1石油類標(biāo)準(zhǔn)使用液，3 個月內(nèi)使用。

1.1.2 儀器設(shè)備

RF-600 型熒光光譜儀(島津通用儀器有限責(zé)任公司)；可調(diào)溫水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buch 公司)；分液漏斗振蕩器、THZ-92A 氣浴恒溫振蕩器(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠)；活性炭層析柱(滁州長城玻璃儀器制造廠)；臺式天平(SL-502 型，上海華巖設(shè)備儀器有限公司)；電子天平(AL204 型，瑞士梅特勒-托利多儀器公司)；組織搗碎機(jī)(T18 基本型，托利多儀器有限公司)；具塞皂化瓶，聚四氟乙烯分液漏斗。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取(2.0±0.2) g 完全解凍的樣品于100 mL 皂化瓶中，加入6 mol·L-1氫氧化鈉溶液20 mL，手動振蕩混合均勻，轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器中需避光40 ℃、1 500 r·min-1振蕩皂化6 h，皂化完全后瓶中無塊狀樣品。加入20 mL 無水乙醇搖晃使反應(yīng)混合更加充分，靜置2 h 后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯分液漏斗中。分別用二氯甲烷10 mL 沖洗皂化瓶2 次均倒入分液漏斗中，加入100 mL 水和30 mL 飽和氯化鈉溶液防止乳化，手動搖晃適當(dāng)放出氣體后再放置到分液漏斗振蕩器2 500 r·min-1振蕩2 min，充分萃取后靜置至明顯分層，收集下層二氯甲烷于雞心瓶中，40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速10～15 r·min-1為宜)濃縮至干，冷卻到室溫后加入10 mL脫芳石油醚，搖晃雞心瓶使內(nèi)壁充分蕩洗后靜置待測，同時做空白對照實(shí)驗。

1.2.2 測定波長

設(shè)置RF-600 型熒光光譜儀的狹縫寬度均為5 nm，光譜儀的掃描速度為10 000 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射波長的采樣間隔分別為5 nm 和2 nm；激發(fā)和發(fā)射波長均設(shè)置為200～450 nm。濃度為5.0 mg·L-1的石油烴標(biāo)準(zhǔn)液三維相關(guān)光譜如圖1 所示。由圖1 可知，石油烴的三維相關(guān)光譜主要存在2 個明顯的熒光特征峰，中心峰位于Ex/Em=230/340 nm 附近的熒光峰和位于Ex/Em=270/314 nm 附近的熒光峰，石油烴在Ex/Em=270/314 nm位置具有最大熒光強(qiáng)度?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《GB 17378.6-2007 國家海洋監(jiān)測規(guī)范(第六部分:生物體分析)》中使用Ex/Em=310/360 nm位置熒光強(qiáng)度則較弱。

圖1 5.0 mg·L-1 石油標(biāo)準(zhǔn)溶液三維相關(guān)光譜圖Fig.1 Three-dimensional correlation of petroleum hydrocarbon at 5.0 mg·L-1

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.2.2 所得石油烴特征峰光譜條件和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中光譜條件，分別取油標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以樣品相同的條件進(jìn)行皂化反應(yīng)及萃取、濃縮、復(fù)溶等操作，采用Ex/Em=310/360 nm條件下測定各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行計算，以熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)Y，石油烴的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品測定

海捕魚樣品經(jīng)皂化、萃取、濃縮、復(fù)溶靜置沉淀后，轉(zhuǎn)移適量上清液至1 cm 光程的適應(yīng)比色皿中進(jìn)行測定，根據(jù)其在Ex/Em=310/360 nm 條件下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出海捕魚樣品中石油烴含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 皂化條件的選擇

2.1.1 樣品狀態(tài)

由于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)皂化條件過于耗時耗力，本實(shí)驗在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。實(shí)驗中影響皂化結(jié)果的條件主要有樣品狀態(tài)、樣品種類、皂化溫度、搖動力度及頻率、皂化時間等。海捕魚樣品-18 ℃冷凍保存后為堅硬塊狀，若解凍不充分，則大大延長了皂化時間，且影響皂化進(jìn)度及效果，故樣品需充分解凍為肉糜狀后方可進(jìn)行皂化，在批量檢測海捕魚樣品中石油烴時可提前對相應(yīng)的樣品進(jìn)行解凍。以鰻魚樣品和黃姑魚樣品為例，未充分解凍海捕魚樣品對皂化結(jié)果的影響見表1。

表1 海捕魚樣品狀態(tài)對皂化結(jié)果的影響Tab.1 Effect of sea fishes sample status on saponification results

2.1.2 皂化條件

樣品的皂化過程是由過量的氫氧化鈉作為反應(yīng)物質(zhì)的復(fù)雜反應(yīng)[19]。皂化條件主要包括溫度、振蕩轉(zhuǎn)速及時間，在一定范圍內(nèi)，提高溫度、加大振蕩轉(zhuǎn)速均有利于縮短皂化過程的時間。批量檢測海捕魚樣品中石油烴含量的實(shí)驗中，實(shí)驗室常用使樣品皂化過程保持一定溫度的方式有恒溫水浴和恒溫氣浴2 種[20]。實(shí)驗發(fā)現(xiàn):恒溫水浴和恒溫氣浴2 種方式對皂化時間及皂化效果無明顯差異，而恒溫氣浴則更加方便操作，故本實(shí)驗選擇恒溫氣浴方式進(jìn)行。樣品皂化過程溫度選擇實(shí)驗使用恒溫氣浴振蕩器，振蕩轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1下分別選擇氣浴溫度30、35、40、45 ℃進(jìn)行對比試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣溫越高皂化速度越快，在溫度40 ℃時選擇的4 種海捕魚樣品均能在不超過6 h 就完全皂化；溫度45 ℃時雖然皂化耗時更短，但不明顯，且皂化瓶玻璃塞常有沖出，導(dǎo)致皂化液體濺出，故本實(shí)驗選擇氣浴溫度為40 ℃。多種海捕魚樣品皂化反應(yīng)耗時見表2。

表2 海捕魚樣品皂化反應(yīng)耗時表Tab.2 Time of sea fishes sample saponification reaction

2.2 熒光條件

文獻(xiàn)中關(guān)于熒光條件選擇以《GB 17378.6-2007 國家海洋監(jiān)測規(guī)范(第六部分:生物體分析)》為準(zhǔn)，即Ex/Em=310/360 nm 時測定樣品中石油烴熒光強(qiáng)度，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品石油烴含量。經(jīng)實(shí)驗對石油烴標(biāo)準(zhǔn)品在激發(fā)波長200～450 nm 范圍、發(fā)射波長在200～450 nm 范圍進(jìn)行三維熒光掃描后發(fā)現(xiàn):石油烴標(biāo)準(zhǔn)品在Ex/Em=230/340 nm 時具有最高熒光強(qiáng)度響應(yīng)值，在Ex/Em=270/314 nm 時具有較高熒光強(qiáng)度響應(yīng)值，而在Ex/Em=310/360 nm 時熒光強(qiáng)度響應(yīng)值很低。在3 組熒光條件下分別做加標(biāo)回收實(shí)驗對比，結(jié)果顯示在Ex/Em=310/360 nm 時回收率能滿足樣品檢測質(zhì)控要求，而另外2 組熒光條件回收率都偏高。故熒光條件選擇Ex/Em=310/360 nm。

圖2 試劑空白三維相關(guān)光譜圖Fig.2 Three-dimensional correlation of reagent blank

圖3 鰻魚樣品三維相關(guān)光譜圖Fig.3 Three-dimensional correlation of eel samples

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

根據(jù)1.2.2 所得石油烴特征峰光譜條件和現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中光譜條件，分別取石油標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.1、0.3、0.5、0.7 mL 于皂化瓶中以樣品相同的條件進(jìn)行皂化反應(yīng)及萃取、濃縮、復(fù)溶等操作，采用Ex/Em=230/340 nm、Ex/Em=270/314 nm 和Ex/Em=310/360 nm 條件下測定各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行計算，以熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)Y，石油烴的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3 組熒光條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖4。線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，可滿足石油烴定量要求。

圖4 石油烴測定標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of petroleum hydrocarbon

2.4 方法回收率和精密度

以帶魚和鯧魚樣品作為實(shí)驗基質(zhì)在熒光條件Ex/Em=310/360 nm 下做2 組加標(biāo)回收實(shí)驗，同時做空白對照實(shí)驗，扣除背景值計算回收率。每組4 個石油類標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)水平分別是2.0、5.0、10、20 mg·kg-1，準(zhǔn)確稱取帶魚樣品和鯧魚樣品各2.0 g，每個水平做6 個平行，測定石油烴含量，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。計算結(jié)果如表3 所示，方法回收率為80%～102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.0%，數(shù)據(jù)表明實(shí)驗方法有較高的回收率和精密度。

表3 樣品中添加回收率及方法的精密度試驗(n=6)Tab.3 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples(n=6)

2.5 樣品測定結(jié)果

使用該方法對來自舟山市普陀區(qū)、嵊泗縣、岱山縣、定海區(qū)捕撈漁船和漁獲運(yùn)輸船共99 批次海捕魚進(jìn)行測定，其中鯧魚樣品15 批次，占比15%；帶魚樣品26 批次，占比26%；鰻魚樣品22 批次，占比22%；小黃魚樣品11 批次，占比11%；鲅魚樣品9批次，占比9%；其他魚類樣品16 批次，占比16%。海捕魚樣品種類分布比例如圖5。

圖5 海捕魚種類分布比例圖Fig.5 The proportion of sea fishes species

分析測定結(jié)果顯示各相關(guān)海捕魚樣品中石油烴的含量，測定結(jié)果見表4。由表可知:石油烴檢出率為90.9%，檢出值在1.1～20 mg·kg-1，且部分樣品檢出值較高。其他海捕魚樣品中，1 份舌鰨樣品和1 份白姑魚未檢出，鮐魚含量最高為9.4 mg·kg-1。舟山港口及船舶工業(yè)發(fā)達(dá)，同時受2018 年年初“桑吉”輪沉船事故影響，給舟山海域水產(chǎn)品帶來較大的石油烴污染風(fēng)險。

表4 部分海捕魚中石油烴的含量Tab.4 The amount of petroleum hydrocarbon in different sea fishes

3 結(jié)論

實(shí)驗對熒光分光光度法測定海捕魚肌肉組織中石油烴含量進(jìn)行了研究，主要對操作過程中皂化條件以及儀器測定時熒光光譜條件的選擇做了改進(jìn)。現(xiàn)行的《GB 17378.6-2007 國家海洋監(jiān)測規(guī)范(第六部分:生物體分析)》作為海洋環(huán)境監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，其關(guān)于生物體中石油烴的測定更加側(cè)重于海洋環(huán)境的監(jiān)測，通過監(jiān)測海洋生物體石油烴的含量來評判海洋環(huán)境現(xiàn)狀。尋求更加適合水產(chǎn)品質(zhì)量安全管理方面的測定海捕魚中石油烴的方法，為以后建立測定水產(chǎn)品中石油烴的標(biāo)準(zhǔn)做出一點(diǎn)探索。利用三維相關(guān)光譜技術(shù)分析了海捕魚中石油烴檢測的熒光條件，Ex/Em=230/340 nm 及Ex/Em=270/314 nm 時熒光強(qiáng)度高，回收率偏高；Ex/Em=310/360 nm 時熒光強(qiáng)度偏低，但回收率能滿足實(shí)驗室質(zhì)控要求。Ex/Em=310/360 nm 時熒光強(qiáng)度偏低，但回收率能滿足實(shí)驗室質(zhì)控要求。

在測定海捕魚中石油烴含量的實(shí)驗中，注意皂化反應(yīng)必須進(jìn)行徹底，不能使用凡士林涂抹分液漏斗，旋蒸時需控制轉(zhuǎn)速以保證不產(chǎn)生暴沸，不能使用封口膜對旋蒸瓶進(jìn)行封口，復(fù)溶樣品須靜置沉淀后取上清液進(jìn)行測定。此方法中試劑干擾小，測定結(jié)果能反映真實(shí)情況，具有較好的重現(xiàn)性和較高的精密度，更加適用于海捕魚樣品中石油烴的批量檢測。