2 種帶魚科魚類線粒體COI 基因片段的比較分析

斯舒謹(jǐn)，褚夢(mèng)潔，袁 帆，王忠明，楊天燕，朱文斌

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點(diǎn)漁場(chǎng)漁業(yè)資源科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，浙江舟山 316021)

帶魚Trichiurus lepturus 和沙帶魚Lepturacanthus savala 分別為隸屬于鱸形目Perciformes，帶魚科Trichiuridae，帶魚屬Trichiurus 和沙帶魚屬Lepturacanthus 是海洋中上層兇猛肉食性魚類[1-2]。帶魚在我國(guó)沿海均有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國(guó)的“四大海產(chǎn)”，也是東海漁場(chǎng)最重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一，歷史上漁獲量曾占全國(guó)總產(chǎn)量的80%以上[3-4]。沙帶魚產(chǎn)量相較帶魚少，分布于日本至澳大利亞、馬來半島及印度等近海水域，國(guó)內(nèi)則常見于東海和南海[1-2]，因背鰭金黃，福建沿海又有“黃鰭帶魚”或“黃金帶魚”的俗稱。20 世紀(jì)70 年代中期，隨著海洋捕撈強(qiáng)度的日益增加及環(huán)境的破壞，東海漁業(yè)資源面臨巨大壓力[5]。以帶魚為例，2008-2015 年間東海帶魚資源量發(fā)生劇烈波動(dòng)，呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)。具體表現(xiàn)在群體組成低齡化和小型化、性成熟提前和初次性成熟最小肛長(zhǎng)趨小以及單位漁獲量下降等方面[6-7]。近年來，隨著拖網(wǎng)和帆張網(wǎng)等主要帶魚捕撈作業(yè)方式減船轉(zhuǎn)產(chǎn)、伏季休漁延長(zhǎng)、產(chǎn)卵場(chǎng)保護(hù)區(qū)設(shè)立、執(zhí)法力度加大，帶魚資源狀況有好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)嚴(yán)格遵守母系遺傳、具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單穩(wěn)定、可溯源性強(qiáng)等特點(diǎn)，隨著DNA 測(cè)序技術(shù)和分子信息學(xué)的快速發(fā)展，mtDNA 在魚類系統(tǒng)學(xué)、種間雜交漸滲、群體遺傳學(xué)等方面得到廣泛應(yīng)用，成為當(dāng)今分子生物學(xué)研究中的一個(gè)熱門領(lǐng)域[8-10]。細(xì)胞色素c 氧化酶亞基I(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因是線粒體DNA 中13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一，因攜帶的遺傳信息量大、進(jìn)化速率適中、解析能力強(qiáng)，主要應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析、種類鑒定以及DNA 條形碼研究等領(lǐng)域[11-12]。

本研究分別選取我國(guó)舟山帶魚和北海沙帶魚為研究對(duì)象，采用線粒體COI 基因片段序列作為分子標(biāo)記，探討2 種帶魚科魚類線粒體COI 基因片段序列的差異性，以期為帶魚和沙帶魚的種質(zhì)資源保護(hù)研究和開發(fā)利用提供遺傳背景資料，并為帶魚科魚類分類和系統(tǒng)進(jìn)化提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料為2019 年7-9 月采集自舟山近海的帶魚和廣西沿海的沙帶魚，2 種魚類樣本共計(jì)52 尾(圖1)。所有樣品取背部新鮮肌肉組織存放于5 mL 離心管，加入無水乙醇置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣本?shù)量、采集時(shí)間和地點(diǎn)信息如表1 所示。

圖1 2 種帶魚科魚類的采樣圖(括號(hào)數(shù)字代表樣本數(shù)量)Fig.1 The sampling locations of two Trichiuridae fishes (numbers in brackets represent the number of samples)

1.2 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

剪取適量背部肌肉組織，采用傳統(tǒng)的Tris 酚-氯仿法[13]提取帶魚和沙帶魚基因組DNA，將75%乙醇沉淀后經(jīng)自然風(fēng)干的DNA溶解于100 μL 滅菌水中，并放于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜跀U(kuò)增COI 基因序列的正反向引物分別為COI-F:5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′和COI-R:5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。PCR 總反應(yīng)體系為25 μL，各試劑劑量和引物劑量如表1 所示。

表1 PCR 反應(yīng)體系Tab.1 The PCR reaction system

PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性0.5 min，54 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.25 min 循環(huán)35 次；72 ℃延伸5 min。用濃度1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)拍照后，挑選條帶亮度較高的PCR 產(chǎn)物送至上海桑尼生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DNAstar Lasergene 7.1 軟件包[14]中的MegAlign 和Seqman 程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)和編輯；采用DnaSP 6.0 軟件[15]計(jì)算2 種魚類的單倍型數(shù)(H)、核苷酸多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)；DAMBE 軟件[16]進(jìn)行堿基替換飽和性分析；使用MEGA 6.0 軟件[17]分析序列堿基組成和變異位點(diǎn)情況，基于Kimura 2-Parameter(K2P)模型計(jì)算群體間遺傳距離并構(gòu)建鄰接系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度采用自展法重復(fù)1 000 次檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 COI 基因序列特征

經(jīng)比對(duì)和校正去除序列兩端測(cè)序不準(zhǔn)確部分，最終得到52 條長(zhǎng)度為550 bp 的帶魚和沙帶魚COI基因同源序列。利用MEGA 軟件計(jì)算序列堿基組成如表2 所示。從堿基組成來看，沙帶魚的T 堿基含量最高，而帶魚C 含量最高，但2 種帶魚科魚類G 含量都最低，且A+T 含量大于C+G 含量，這與脊椎動(dòng)物線粒體DNA 的特征相符[18]。堿基轉(zhuǎn)換明顯大于顛換，轉(zhuǎn)換/顛換(R)平均值為2.72，變化范圍在2.65～10.43 之間。4 種堿基在密碼子第1、2、3 位點(diǎn)的平均含量存在一定差別，其中第1 位點(diǎn)各堿基含量差別較小，第2 位點(diǎn)T 堿基含量偏高而A、G 堿基含量大致相當(dāng)，G 含量偏低這一現(xiàn)象在密碼子第3 位點(diǎn)尤為突出(圖2)。在183 個(gè)三聯(lián)體密碼子中，第1 位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的有37 個(gè)(27 個(gè)堿基轉(zhuǎn)換、10 個(gè)堿基顛換)，第2 位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的有3 個(gè)(3 個(gè)堿基轉(zhuǎn)換)，第3 位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的有1 個(gè)(1 個(gè)堿基顛換)，由此可以看出密碼子第1 位點(diǎn)堿基突變數(shù)目明顯高于其它位點(diǎn)。

圖2 帶魚和沙帶魚COI 基因片段密碼子堿基組成Fig.2 Codon composition of COI gene fragment in T.lepturus and L.savala

表2 帶魚和沙帶魚COI 基因片段堿基組成Tab.2 Base composition of COI gene fragments in T.lepturus and L.savala

2.2 遺傳多樣性

2 種魚類COI 基因序列共檢測(cè)到25 種單倍型，其中24 尾帶魚樣品中檢測(cè)到13 種單倍型(DYhap1-DYhap13)，28 尾沙帶魚樣品中存在12 種單倍型(SDYhap14-SDYhap25)。52 條同源序列存在變異位點(diǎn)總計(jì)105 個(gè)，約占序列總長(zhǎng)度的19.1%，其中13 個(gè)帶魚COI 基因序列中有13 個(gè)變異位點(diǎn)、12 個(gè)沙帶魚COI 基因序列中有28 個(gè)變異位點(diǎn)(圖3)。沙帶魚平均單倍型多樣度(Hd)及核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.7169 和0.0050，保守位點(diǎn)數(shù)目為522，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目為28，占位點(diǎn)總數(shù)的5.09%，在28 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，包括單一變異位點(diǎn)(singleton variable sites)21 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)7 個(gè)；帶魚平均單倍型多樣度(Hd)及核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.884 1 和0.004 6，保守位點(diǎn)數(shù)目為537，多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目為13，占位點(diǎn)總數(shù)的2.36%，在13 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，包括單一變異位點(diǎn)4 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)9 個(gè)(表3)。

圖3 COI 基因序列片段單倍型變異位點(diǎn)分布(左圖為帶魚、右圖為沙帶魚)Fig.3 Variable sites of COI gene sequence from different haplotypes (T.lepturus is on the left and L.savala is on the right)

表3 基于線粒體COI 基因的帶魚和沙帶魚遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Genetic diversity indexesbetween T.lepturus and L.savala based on mtDNA COI gene

2.3 遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育

采用Kimura 2-Parameter 模型分別計(jì)算沙帶魚和帶魚種內(nèi)個(gè)體間平均遺傳距離分別為0.004 9 和0.004 5，前者略大于后者?；贑OI 基因序列得到的沙帶魚和帶魚種間的平均遺傳距離為0.165 5，種間的遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)的遺傳距離。

使用DAMBE 軟件進(jìn)行替換飽和性分析，并以堿基轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)為縱軸，以P-distance 模型校正的遺傳距離為橫軸做散點(diǎn)圖(圖4)，顯示堿基轉(zhuǎn)換和堿基顛換均呈直線上升趨勢(shì)，COI 基因序列堿基替換數(shù)與遺傳距離呈顯著的線性關(guān)系且未出現(xiàn)平臺(tái)期，表明用于本研究的基因序列替換未飽和，適用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖5 為基于25 個(gè)單倍型構(gòu)建的鄰接(neighbor-joining，NJ)關(guān)系樹，可以看出2 種帶魚科魚類分別聚類成獨(dú)立的兩支。從NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫下載19 種帶魚科魚類COI 基因序列(表4)，選擇本研究中2 種魚類單倍型數(shù)量最多的各1 條序列作為代表(DYhap2 和SDYhap14)，以花鱸Lateolabrax japonicus(GenBank 登錄號(hào):MF122427)作為外群，比對(duì)截取長(zhǎng)度為504 bp 的同源序列，采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹如圖6 所示。

圖4 線粒體COI 基因堿基替代飽和度分析Fig.4 The substitution saturation analysis of mitochondrial COI gene

表4 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的帶魚科不同物種序列信息Tab.4 Sequences of Trichiuridae fishes used for phylogenetic tree construction

圖5 基于單倍型構(gòu)建的帶魚和沙帶魚NJ 系統(tǒng)樹Fig.5 NJ phylogenetic tree of T.lepturus and L.savala based on haplotypes

圖6 基于鄰接法構(gòu)建的帶魚科魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹Fig.6 The phylogenetic tree of Trichiuridae fishes based on neighbor-joining method

3 討論

全球帶魚科魚類的主要捕撈海域包括西北太平洋、北印度洋和西非，其中西北太平洋是主要產(chǎn)區(qū)。我國(guó)近海5 種主要帶魚科經(jīng)濟(jì)捕撈種類有沙帶魚、小帶魚Eupleurogrammus muticus 以及帶魚屬的帶魚、短帶魚T.brevis 和南海帶魚T.nanhaiensis。因前兩者產(chǎn)量較低且缺乏數(shù)據(jù)資料，在漁業(yè)統(tǒng)計(jì)時(shí)常被統(tǒng)計(jì)為帶魚。作為中國(guó)海洋魚類中捕撈產(chǎn)量最大的品種，20 世紀(jì)90 年代，我國(guó)帶魚科魚類捕撈量就已占全球總產(chǎn)量的60%[4,19]，近年來平均年捕撈產(chǎn)量基本維持在100 萬t 左右[3]。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于帶魚的研究主要集中在漁業(yè)生物學(xué)、種群動(dòng)態(tài)、資源評(píng)估模型應(yīng)用以及遺傳多樣性等方面。舟山帶魚口感鮮嫩、肉質(zhì)細(xì)膩，是我國(guó)首批獲得海鮮類地理標(biāo)志證明的產(chǎn)品，舟山帶魚有別于其他帶魚的優(yōu)越品質(zhì)是否與種質(zhì)因素有關(guān)尚未得知。目前專門針對(duì)舟山近海帶魚種群遺傳學(xué)的研究不多，僅見李鵬飛等[20]曾對(duì)浙江近海帶魚的線粒體COI 基因進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)帶魚該基因變異程度較??；鄭文娟等[21]基于線粒體控制區(qū)對(duì)舟山海域3 個(gè)帶魚地理群體遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)群體間分化程度小、基因交流頻繁，遺傳多樣性處于中等偏下水平。本研究對(duì)采自舟山近海的24 尾帶魚線粒體COI 基因片段序列分析發(fā)現(xiàn)其平均單倍型多樣度(Hd=0.884 1)及核苷酸多樣性指數(shù)(Pi=0.004 6)均低于卞光明等[22]的研究結(jié)果(Hd=0.998 3，Pi=0.006 3)。該結(jié)果顯示近年來舟山近海帶魚遺傳多樣性水平呈現(xiàn)某種程度的下降趨勢(shì)。造成這一差異的原因一方面與采樣地點(diǎn)和取樣數(shù)量有關(guān)。另一方面，由于遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，也是物種和種群長(zhǎng)期續(xù)存的進(jìn)化潛力，遺傳多樣性降低會(huì)引起生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)力的減弱并最終導(dǎo)致滅絕[23-24]。盡管我國(guó)實(shí)行的伏期休漁期制度對(duì)保護(hù)海洋資源起到了積極作用，但日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求對(duì)帶魚野生資源造成的捕撈壓力以及帶魚這種深海魚類難以突破人工繁殖的世界性難題，使得舟山漁場(chǎng)帶魚資源量恢復(fù)緩慢，種群數(shù)量的減少加之棲息地環(huán)境的改變使得舟山帶魚種質(zhì)資源恢復(fù)面臨一定壓力。從2 種帶魚科魚類的遺傳差異來看，沙帶魚多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目、平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多樣性均高于帶魚，表明較之帶魚而言，沙帶魚具有較豐富的遺傳資源和較好的開發(fā)潛力。

線粒體COI 基因作為DNA 條形碼(DNA barcoding)，已廣泛應(yīng)用于昆蟲、鳥類、甲殼類及魚類等物種的快速識(shí)別和鑒定，成為當(dāng)今生態(tài)學(xué)研究的重要工具[25]。HEBERT,et al[26]分析比較了13 320 種生物的線粒體COI 基因序列，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)生物的種內(nèi)遺傳距離差異在0%～2%之間，大于2%非常少，種間遺傳距離則高達(dá)11.3%[26]。本研究發(fā)現(xiàn)沙帶魚和帶魚種間平均遺傳距離為0.165 5，約為種內(nèi)平均遺傳距離(0.004 9和0.004 5)的33～36 倍，表明各物種的COI 序列間已經(jīng)形成明顯“條形碼間隙”(Barcoding gap)，即種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的10 倍及以上[27]?；贙2P 遺傳距離構(gòu)建的NJ 系統(tǒng)樹明顯分為2 支，帶魚和沙帶魚單倍型各自聚在一起，也表明兩種魚類可以得到很好地區(qū)分。結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載的其他19 種帶魚科魚類COI 基因序列進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些魚類按照尾鰭形態(tài)可分為鞭狀和叉狀2 大類群，前者包含了絕大多數(shù)常見的種類，其中帶魚屬和沙帶魚屬親緣關(guān)系最近，兩者聚類后再與小帶魚屬魚類相聚，小帶魚屬是最早分化出來的種類，其次為沙帶魚屬，而帶魚屬則是最新演化的種類；后者主要包含了叉尾帶魚屬和等鰭叉尾帶魚屬魚類，與蔡傳庚對(duì)10 種帶魚科魚類COI 基因聚類的結(jié)果相似[28]。有學(xué)者曾將帶魚科劃分為3 個(gè)亞科，其中等鰭叉尾帶魚亞科Aphanopodinae 包含了等鰭叉尾帶魚屬Aphanopus 和深海帶魚屬Benthodesmus[29]。但從本研究的聚類情況來看，兩者并未聚類到一起，彼此間的演化關(guān)系也不甚明確，還有待于今后增加樣品種類和數(shù)量并結(jié)合其他分子標(biāo)記進(jìn)行深入探討。