響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助法提取青楷槭葉紅景天苷工藝研究

董艷秋 谷會(huì)巖

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150040；2.克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司新疆克拉瑪依 834000）

青楷槭（Acer tegmentosumMaxim.）又名青楷子，別名遼東槭，槭樹(shù)科落葉喬木[1-2]，國(guó)內(nèi)分布于東北三省、河北和山東地區(qū)，國(guó)外分布于韓國(guó)、朝鮮和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，青楷槭樹(shù)皮和樹(shù)葉化學(xué)成分含有大量的藥用化合物，具有解酒護(hù)肝和抗腫消炎的作用，藥用價(jià)值巨大[4-5]。

紅景天苷是紅景天根莖的主要有效成分，具有抗氧化、耐高山缺氧功效。由于紅景天多生長(zhǎng)在高海拔、較為寒冷地帶，導(dǎo)致紅景天苷資源匱乏，不能滿足市場(chǎng)需求。近年來(lái)研究表明，青楷槭葉中含有紅景天苷。青楷槭樹(shù)葉生長(zhǎng)量大，資源豐富，適合于規(guī)?；崛〖t景天苷。因此，利用青楷槭葉代替紅景天根莖，獲取紅景天苷，可以改善資源缺乏現(xiàn)象。目前藥理研究證明，紅景天苷對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)及代謝系統(tǒng)具有良好的調(diào)理作用，還具有治愈糖尿病、降低細(xì)胞毒性、抑菌活性、修復(fù)細(xì)胞損傷等作用[6-9]。

超聲提取技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、消耗溶劑低、得率高、無(wú)需加熱等特點(diǎn)[10-11]。超聲波提取原理主要為物理過(guò)程，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)和空化效應(yīng)加速植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放、擴(kuò)散并溶入溶劑中，同時(shí)可保持被提取物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性不發(fā)生變化。超聲提取也是目前比較常用的方法，與傳統(tǒng)方法相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、材料工業(yè)。本研究利用超聲法，以紅景天苷為指標(biāo)成分，應(yīng)用響應(yīng)面分析法[12-15]研究超聲功率、時(shí)間、溫度等因素對(duì)紅景天苷得率的關(guān)系；同時(shí)以紅景天苷得率為響應(yīng)因子，對(duì)青楷槭葉中紅景天苷成分進(jìn)行提取，對(duì)超聲提取過(guò)程中的各因素進(jìn)行優(yōu)化，為規(guī)模生產(chǎn)提供工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青楷槭葉2018年7月采集于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)谷會(huì)巖教授鑒定。將野外采集的青楷槭葉自然陰干，用中藥粉碎機(jī)粉碎并過(guò)180～250 μm篩，取過(guò)篩后的粉末作為實(shí)驗(yàn)樣品。對(duì)照品紅景天苷（純度97%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，色譜級(jí)甲醇購(gòu)于賽莫非世爾科技（中國(guó)）有限公司，分析純乙醇購(gòu)于天津市天士力化學(xué)試劑有限公司，去離子水自制。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助法提取青楷槭葉中的紅景天苷精確稱取一定量的青楷槭葉原料粉末，加入乙醇水溶液中，超聲輔助提取，得到提取液，冷卻至室溫，真空抽濾，取2 mL濾液用0.45 μm一次性濾膜過(guò)濾，過(guò)膜后的清液采用HPLC檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅景天苷濃度，再計(jì)算得率。分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取功率、提取溫度，其他相同條件不變，得到最佳的提取方法。

1.2.1 .1 乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，乙醇體積分?jǐn)?shù)0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；分別加入10 mL提取溶劑，稱取0.5 g青楷槭原料粉末，超聲功率180 W，超聲溫度50℃，提取20 min，將提取液冷卻后過(guò)濾；采用HPLC檢測(cè)，計(jì)算紅景天苷的得率。

1.2.1 .2 液料比分別精確稱取 0.333、0.400、0.500、0.667、1.000 g的青楷槭原料粉末，加入上一因素最佳濃度的乙醇水溶液（50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇10 mL）；超聲功率180 W，超聲溫度50℃，提取 20 min，將提取液冷卻后過(guò)濾；采用 HPLC檢測(cè)，計(jì)算紅景天苷的得率。

1.2.1 .3 超聲溫度選擇最佳液料比及乙醇體積分?jǐn)?shù)，青楷槭原料粉末0.500 g，50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇10 mL，分別設(shè)置超聲溫度30、40、50、60℃；超聲功率180 W，提取20 min，將提取液冷卻后過(guò)濾；采用HPLC檢測(cè)，計(jì)算紅景天苷的得率。

1.2.1 .4 超聲功率稱取青楷槭原料粉末0.5 g，50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇 10 mL，超聲溫度 50℃、超聲時(shí)間 20 min，設(shè)置超聲功率 72、108、144、180 W，超聲提取后將提取液冷卻過(guò)濾；采用HPLC檢測(cè)，計(jì)算紅景天苷的得率。

1.2.1 .5 超聲時(shí)間選擇最佳液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及超聲溫度，即青楷槭原料粉末0.500 g，50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇 10 mL，超聲溫度 50℃；在超聲功率180 W的條件下，分別超聲提取5、10、20、30、40、50、60 min，將提取液冷卻后過(guò)濾；采用HPLC檢測(cè)，計(jì)算紅景天苷的得率。

1.2.2 高效液相色譜定量測(cè)定紅景天苷

1.2.2 .1 定量測(cè)定條件采用安捷倫1260高效液相色譜儀測(cè)定，紫外二極管陳列檢測(cè)器。色譜柱型號(hào)為Phenomenex CuroSil-PFP （柱長(zhǎng)250 mm、內(nèi)徑4.6 mm、填料粒徑5 μm）；流動(dòng)相：超純水加三氟乙酸（A）和甲醇（B）體系；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；運(yùn)行時(shí)間：60 min；采用甲醇-0.1%三氟乙酸（V∶V=15∶85）等度洗脫。

1.2.2 .2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取對(duì)照品紅景天苷2.5 mg置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，得每毫升分別含紅景天苷0.1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用；分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4和6 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，配成不同濃度的對(duì)照品溶液；依次取 10 μL上述對(duì)照品溶液進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù) 3次；按上述色譜條件測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.2 .3 樣品中紅景天苷的含量測(cè)定將提取液過(guò)0.45 μm濾膜，取上清液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每樣重復(fù)進(jìn)樣3次，將峰面積取平均值，代入回歸方程，依式（2）計(jì)算紅景天苷的得率。

式中：Y，得率（mg/g）；c，紅景天苷的濃度（mg/mL）；V，提取液體積（mL）；M，原料重量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

紅景天苷在0～5 mg/mL呈良好的線性關(guān)系。線性擬合方程式為：y=183 588x+190.96（1），R2=0.997 0，其中，x為對(duì)照品的濃度（mg/mL），Y為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)應(yīng)的峰面積（圖1）。

圖1 紅景天苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素的影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，得率最高，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)提高時(shí)，得率開(kāi)始下降。綜合考慮，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%為最優(yōu)提取濃度。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅景天苷得率的影響

2.2.2 液料比的影響當(dāng)固定超聲功率為180 W、提取時(shí)間為20 min、處理溫度為50℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，考察液料比對(duì)紅景天苷得率的影響。由圖3可以看出，隨著液料比的增大，紅景天苷的得率逐漸增大，當(dāng)液料比為20∶1[V（mL）∶m（g）]時(shí)得率最大，當(dāng)液料比繼續(xù)增大時(shí)，紅景天苷的得率趨于平緩。可見(jiàn)當(dāng)原料和溶劑達(dá)到一定量時(shí)，接觸面積較為充分，但當(dāng)原料繼續(xù)增加，得率反而下降，也會(huì)造成原料浪費(fèi)。所以選擇20∶1為最優(yōu)液料比。

圖3 液料比對(duì)紅景天苷的影響

2.2.3 超聲溫度的影響固定超聲功率為180 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 50%，液料比為 20∶1，分別在不同的超聲溫度下提取20 min。從圖4可以看出，隨著超聲溫度的不斷升高，得率明顯增高，當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)得率最高；而當(dāng)溫度為60℃時(shí)，得率就有下降趨勢(shì)，原因可能是由于溫度太高提取溶劑有所揮發(fā)，也有可能是高溫導(dǎo)致物質(zhì)分解，因此，選擇50℃作為最佳超聲溫度。

圖4 超聲溫度對(duì)紅景天苷的影響

2.2.4 超聲功率的影響固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為 20∶1，提取溫度為 50℃，分別在不同的超聲功率下提取20 min。從圖5可知，超聲功率越大紅景天苷得率越高，當(dāng)超聲功率為180 W 時(shí)得率最高，這是由于此時(shí)的超聲的空化作用和機(jī)械作用效果最佳。因此選擇180 W作為最佳超聲功率。

圖5 超聲功率對(duì)紅景天苷的影響

2.2.5 超聲時(shí)間的影響固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，液料比為 20∶1，提取溫度為 50℃，在超聲功率180 W條件下提取不同時(shí)間。超聲時(shí)間對(duì)得率的影響如圖6所示。當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，紅景天苷得率最高，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)得率趨于平緩，即當(dāng)原料和提取液的濃度達(dá)到平衡動(dòng)態(tài)時(shí)紅景天苷的得率才保持恒定。所以選擇20 min為最佳超聲時(shí)間。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)紅景天苷的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化參數(shù)分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用 Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并用Box-Benken組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。影響青楷槭葉中紅景天苷提取得率有很多因素，如提取溶劑、液料比等，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲溫度（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）3個(gè)自變量作為主要考察對(duì)象，以紅景天苷得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化條件，分析本實(shí)驗(yàn)不同因素之間的相互影響，并結(jié)合作圖分析，獲得紅景天苷的最佳提取參數(shù)。自變量因素和水平見(jiàn)表1。

表1 超聲法提取紅景天苷響的應(yīng)面分析因素及水平

使用Design-Expert軟件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果（表2）進(jìn)行方差分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）對(duì)影響超聲輔助提取青楷槭中紅景天苷得率的因素進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅景天苷得率與超聲提取各因素變量的二次方程模型為：

響應(yīng)面數(shù)據(jù)如表2所示，為了降低實(shí)驗(yàn)誤差，本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。方差分析結(jié)果如表3所示，經(jīng)軟件分析可知，該模型回歸顯著（p＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說(shuō)明上述回歸方程對(duì)于本實(shí)驗(yàn)擬合較好。根據(jù)回歸方程做響應(yīng)面圖（圖7～9），分析超聲溫度、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)青楷槭葉中紅景天苷得率的影響。根據(jù)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得到最佳超聲優(yōu)化條件為超聲溫度42℃、超聲功率158 W、超聲時(shí)間20 min，此時(shí)紅景天苷的得率最大，為0.086 mg/g。

圖7 超聲功率與超聲溫度交互作用對(duì)青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應(yīng)面圖

表2 超聲輔助提取青楷葉中紅景天苷響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作方法對(duì)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，確定提取參數(shù)超聲溫度50℃、超聲功率180 W、超聲時(shí)間20 min為青楷槭葉中紅景天苷提取的最優(yōu)參數(shù)。

3 結(jié)論

采用超聲輔助法提取青楷槭葉中的紅景天苷，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面分析，優(yōu)化超聲輔助法提取青楷槭葉中紅景天苷的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)選擇用乙醇溶液作為提取溶劑，測(cè)試了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)紅景天苷得率的影響。結(jié)果得出，最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比為20∶1 [V（mL）∶/m（g）]、超聲溫度為50℃、超聲功率180 W、超聲時(shí)間20 min。超聲輔助提取的方法具有操作便捷、用時(shí)短、得率高、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，具有更好的應(yīng)用價(jià)值。

圖8 超聲時(shí)間與超聲溫度交互作用對(duì)青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應(yīng)面圖

圖9 超聲時(shí)間與超聲功率交互作用對(duì)青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應(yīng)面圖