響應(yīng)面優(yōu)化咖啡山荊子復(fù)合飲料的制備工藝

李澤林 趙春燕 張楠 丁媛婧 范江平 沈曉靜,2,3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 云南昆明 650201；3.云南省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/昆明醫(yī)科大學(xué) 云南昆明 650500）

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，主要分布在南美、中美洲、非洲和亞洲等國家，全球超過80個(gè)國家種植[1]，具有醒神、利尿、健胃的功效，主治精神倦怠、食欲不振，常作為醒神、利尿和健胃藥使用?，F(xiàn)代研究表明，咖啡中含有生物堿、酚酸類、黃酮類、萜類等多種活性成分，具有肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、降血糖、抗糖尿病等多種藥理活性[2-4]。

此外，咖啡因其獨(dú)特的風(fēng)味而成為世界三大飲品之首，且已成為全球第二大貿(mào)易商品。我國咖啡種植以小?？Х葹橹?，且99%以上分布在云南的德宏、普洱、保山、西雙版納、臨滄等地[5]。云南獨(dú)特的地理環(huán)境、高原氣候和多樣復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，造就了云南小?？Х葍?nèi)含物質(zhì)豐富，除咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等成分外，還含有mascarosides I～I(xiàn)I、paniculoside VI、cofaryloside I和 villanovane Ⅰ[6]、caffarolides A～H[7]、caffruenol A-B、caffruones A-D[8]和 caffruolide A-B[9]等一些新型萜類化合物。其中，caffarolides C、D 和 F被證實(shí)具有一定的體外激活血小板聚集的活性；caffruenol A-B和caffruolide A-B具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的264.7巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的作用。同時(shí)，這些化合物的差異也使得云南小粒咖啡果實(shí)多油、多果香味，口感濃而不苦，香而不烈，具有較高的杯測(cè)值，備受大眾喜愛[10-11]。

近年來，云南小?？Х犬a(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，世界性消費(fèi)越來越多，因此，小?？Х纫脖患庸こ筛鞣N形式的咖啡產(chǎn)品以提高其價(jià)值[12]。如楊洋等[13]優(yōu)化了小粒咖啡乳飲料產(chǎn)品配方；王燕等[14]以咖啡為主要原料，按40%綠豆汁、0.5%咖啡、9%蔗糖，0.02%黃原膠、0.1% CMC-Na和0.01%海藻酸鈉的配方研制了綠豆咖啡復(fù)合飲料；還有紅豆咖啡[15]、枸杞咖啡[16]、苦丁茶牛奶咖啡[17]等多種復(fù)合飲料被研制。此外，王祥[18]還以咖啡和決明子為原料研制了決明子-咖啡降脂復(fù)合飲料。

麗江山荊子[Malus rockii Rehd.(M.baccata var.himalaica (Maxim.) Schneid.]又名麗江山定子、喜馬拉雅山荊子、海棠果，屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）山荊子系植物，是云南麗江特有的一種野生水果[19]。成熟的麗江山荊子呈鮮紅色，酸甜可口、細(xì)脆多汁，深得當(dāng)?shù)鼐用竦南矏踇20]?！吨袊{西康巴醫(yī)藥學(xué)》中記載了麗江山荊子可緩解兒童小便不暢和關(guān)節(jié)疼痛，后證實(shí)是山荊子中含有的多酚以及花青素類生物活性物質(zhì)發(fā)揮了重要作用[21-22]。此外，麗江山荊子中含有的表兒茶素也是一類具有抗炎癥、抗菌抗氧化等活性的黃酮類物質(zhì)。李澤林等[23]研究發(fā)現(xiàn)，表兒茶素可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物緩解急性肺損傷炎癥。王玉涵等[24]發(fā)現(xiàn)，表兒茶素對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有一定的保護(hù)作用。據(jù)當(dāng)?shù)鼐用窠榻B，山荊子主要是切片曬干當(dāng)做零食食用，少數(shù)用來制作泡酒，很少有文獻(xiàn)報(bào)道用其制作復(fù)合飲料，目前還得不到廣泛的應(yīng)用及開發(fā)。

本文以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，采用云南小粒種咖啡和麗江山荊子為原料，通過 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化云南小?？Х壬角G子復(fù)合飲料的工藝，并檢測(cè)其微生物指標(biāo)及抗氧化活性，旨在為云南小?？Х群望惤角G子的綜合運(yùn)用以及深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材深度烘焙咖啡豆（卡蒂姆），云南朱苦拉咖啡有限公司；麗江山荊子，采自云南省麗江市；白砂糖，耿馬南華糖業(yè)有限公司；檸檬酸、異抗壞血酸鈉，昆明順佳商貿(mào)有限公司；大腸桿菌測(cè)試片，廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司；DPPH、ABTS+分析純，天津市興復(fù)精細(xì)化工有限公司；食品級(jí)羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和β-葡聚糖，河南恩苗食品有限公司。

1.1.2 儀器L18-Y916榨汁機(jī)，九陽股份有限公司；CK5300咖啡豆研磨機(jī)，Cafede Kona公司；APV-1000高壓均質(zhì)機(jī)，深圳市榮利豐科技有限公司；JC-SY-1恒溫水浴鍋，南通嘉程儀器有限公司；HX1002Z電子天平，慈溪市天東衡器廠；UV-2600紫外分光光度計(jì)，北京京科瑞達(dá)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程咖啡液和山荊子果汁調(diào)配→均質(zhì)→脫氣→預(yù)熱→灌裝→封口→殺菌→冷卻→成品。

1.2.2 原料預(yù)處理（1）咖啡液的提?。嚎Х确鬯楹?，過 40目篩，按料液比 1:15（g/mL）90℃水沖泡后，濾紙過濾，冷卻到室溫待用。

（2）山荊子果汁的制備：選擇無蟲害、顏色偏紅、果實(shí)體完好的果子，清洗去核。按山荊子鮮果:水 1:1.5（g/mL）的料液比榨汁，4層紗布過濾3次，加入0.2%異抗壞血酸鈉護(hù)色15 min，待用。

（3）0.2%復(fù)合穩(wěn)定劑：參考黃玉坤等[25]的方法，按羧甲基纖維素鈉∶海藻酸鈉∶β-葡聚糖質(zhì)量比2:1:1制備。

1.2.3 復(fù)合飲料的制備（1）調(diào)配：按照一定的體積比加入咖啡液和山荊子果汁，再加入白砂糖、檸檬酸進(jìn)行預(yù)混，最后加入0.2%的復(fù)合穩(wěn)定劑加熱攪拌溶解，待基本溶解完全后殺菌30 min。

（2）均質(zhì)、脫氣：25 MPa，50℃條件均質(zhì)，重復(fù)2次；均質(zhì)完成后，放涼脫氣。

（3）預(yù)熱、罐裝、封口、殺菌：罐裝前60℃預(yù)熱10 min，玻璃罐沸水煮10 min滅菌；將飲料灌裝后，沸水浴滅菌30 min，冷卻至室溫得成品。

1.2.4 單因素試驗(yàn)按照工藝流程，分別對(duì)原料配比、白砂糖添加量、檸檬酸添加量進(jìn)行調(diào)控，對(duì)咖啡山荊子復(fù)合飲料的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。

（1）原料配比（咖啡液:山荊子果汁）：固定白砂糖添加量（20%），檸檬酸添加量（0.04%），考察原料配比（V/V，4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）對(duì)咖啡山荊子復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。

（2）白砂糖添加量：固定原料配比（V/V，4:1），檸檬酸添加量（0.04%），考察白砂糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%、30%），對(duì)咖啡山荊子復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。

（3）檸檬酸添加量：固定原料配比（V/V，4:1），白砂糖添加量（20%），考察檸檬酸添加量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）對(duì)咖啡山荊子復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。

1.2.5 復(fù)合飲料響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，以咖啡山荊子復(fù)合飲料感官評(píng)分為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)咖啡山荊子復(fù)合飲料的制備工藝，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用三因素三水平的試驗(yàn)優(yōu)化咖啡山荊子復(fù)合飲料工藝配方，如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.6 檢測(cè)分析

1.2.6 .1 感官評(píng)定以色澤、口感、香味、組織狀態(tài)為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)，參考石文貞[26]、楊呂清等[27]等方法，選取嗅覺、味覺敏感且無不良嗜好，有復(fù)合飲料相關(guān)領(lǐng)域品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人士10人（男女各5名）組成評(píng)鑒小組，采用盲樣評(píng)定法對(duì)復(fù)合飲料的色澤、口感、香味、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表

1.2.6 .2 微生物指標(biāo)的測(cè)定按照 GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》和 GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行菌落總數(shù)、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等微生物測(cè)定。

1.2.6 .3 抗氧化能力的測(cè)定分別采用 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)2種方法對(duì)復(fù)合飲料的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（1）DPPH自由基清除能力參照Victoria等[28]的方法。準(zhǔn)確吸取2 mL待測(cè)樣品溶液，分別加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合均勻后，避光放置30 min，以蒸餾水調(diào)零，在517 nm處測(cè)定吸光度。設(shè)定3組平行，取平均值作為最終結(jié)果。DPPH自由基清除率按以下公式計(jì)算：

式中：A0為蒸餾水代替樣品時(shí)對(duì)照溶液的吸光度；A1為DPPH用無水乙醇代替時(shí)樣品溶液的吸光度；A2為測(cè)試樣品溶液的吸光度。

（2）ABTS+自由基清除能力參照周春峰等[29]的方法。將88 μL的過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）和5 mL ABTS+溶液（7 mmol/L）混合，于黑暗條件下放置24 h，生產(chǎn)ABTS+自由基儲(chǔ)備液。然后，以50倍體積稀釋上述儲(chǔ)備液，使其在734 nm處吸光度為(0.70 ± 0.02)，即得到ABTS+溶液。

吸取不同的待測(cè)樣品溶液200 μL于試管內(nèi)，加入3 mL的ABTS+溶液，空白組用純水代替樣品液，對(duì)照組用純水代替ABTS+溶液，上述3組溶液在室溫下避光放置1 h后，于734 nm處測(cè)定吸光值，設(shè)定3組平行，取平均值作為最終結(jié)果。按照以下公式計(jì)算清除率：

式中：A0為純水代替樣品時(shí)溶液的吸光度；A1為純水代替ABTS+溶液時(shí)樣品溶液的吸光度；A2為測(cè)試樣品溶液的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert.V 8.0.6軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原料配比對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響隨著咖啡原液添加量降低，復(fù)合飲料咖啡苦味降低、既有咖啡的色澤，又能體現(xiàn)山荊子的果香，感官評(píng)分增加。在原料配比為 2:1時(shí)其感官評(píng)分達(dá)到最大值，為87.7分（圖1）。但是當(dāng)果汁含量逐漸增多時(shí)，成品果味較濃，獨(dú)特的咖啡風(fēng)味減少，果酸味增加，復(fù)合飲料酸味增加，咖啡色消失，被接受程度降低。所以，選擇咖啡原料∶山荊子果汁2:1為最優(yōu)值作為后續(xù)研究。

圖1 原料配比對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響

2.1.2 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響隨著白砂糖添加量增加，復(fù)合飲料的甜度增加。當(dāng)白砂糖的添加量為20%時(shí)，成品感官評(píng)分最高，為90.8分（圖2）。添加量小于20%時(shí)，因山荊子果汁本身的酸味和檸檬酸的酸味疊加復(fù)合飲料的口感偏酸；當(dāng)添加量大于20%時(shí)，復(fù)合飲料的咖啡味和果味被增大的甜度掩蓋。所以選擇白砂糖添加量20%為最優(yōu)值作為后續(xù)研究。

圖2 白砂糖添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響檸檬酸不僅可以抑菌、護(hù)色、改進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味、促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化，還可以促進(jìn)食欲且對(duì)身體無副作用。由圖3可知，成品感官評(píng)分在檸檬酸添加量為0.1%時(shí)達(dá)到最高分90.2，添加量小于0.1%時(shí)，山荊子果汁本身的酸味比較單一，導(dǎo)致復(fù)合飲料的口感較差，當(dāng)添加量大于0.1%時(shí)，復(fù)合飲料的咖啡味和果味也同樣被增大的酸味掩蓋。所以選擇檸檬酸加量0.1%為最優(yōu)值作為后續(xù)研究。

圖3 檸檬酸添加量對(duì)復(fù)合飲料感官評(píng)分的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design-Expert.V 8.0.6軟件對(duì)原料配比、白砂糖添加量、檸檬酸添加量進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到如下二次多項(xiàng)回歸方程：感官評(píng)分=90.43-1.11A+ 1.68B-1.15C+1.44AB-1.24AC+2.92BC-5.16A2-5.92B2-4.1 1C2。如回歸方程所示，二次項(xiàng)中A2、B2、C2的系數(shù)都為負(fù)數(shù)，說面響應(yīng)拋物面開口向下，模型存在極大值，因此可被系統(tǒng)優(yōu)化，得到最佳的工藝配方。

響應(yīng)面回歸方差分析結(jié)果見表4，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆O顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)誤差不顯著（p=0.264 4＞0.05）。其中R2=0.976 0，adjR2=0.945 2，pred R2=0.757 0，表明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擁有較高擬合度，預(yù)測(cè)效果較好，模型較合理以及各因素和響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系具有可靠性；相互項(xiàng)BC極顯著，說明檸檬酸添加量和白砂糖添加量存在明顯的交互作用；由F值大小可知，影響復(fù)合飲料感官評(píng)分的各因素主次順序?yàn)椋喊咨疤翘砑恿浚緳幟仕崽砑恿浚驹吓浔龋╒/V）。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.2.2 因素交互作用分析

原料配比、檸檬酸添加量和白砂糖添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。

由圖4-a～4-c可知，隨著咖啡和果汁的比例降低、檸檬酸和白砂糖添加量的增加，感官評(píng)分都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，白砂糖添加量曲面上升幅度稍比檸檬酸幅度大，而咖啡和果汁不同比例曲面上升幅度相對(duì)最小，說明三者對(duì)飲料感官評(píng)分影響確實(shí)存在大小不一的順序，即白砂糖添加量＞檸檬酸添加量＞原料配比。由圖4-d～4-f可知，高線圖均呈橢圓形，證明3個(gè)因素中兩兩之間存在一定的交互作用，但是只有檸檬酸添加量和白砂糖添加量2個(gè)因素存在顯著的交互作用（p＜0.01）。

圖4 各因素交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的三維曲面和等高線

2.2.3 最優(yōu)工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)感官評(píng)分響應(yīng)面回歸方程分析，得到云南小粒咖啡山荊子復(fù)合飲料模型預(yù)測(cè)工藝：原料配比（V/V）為2.84:1，白糖添加量24.02%和檸檬酸添加量0.10%，其感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為86.22分。以此條件進(jìn)行 3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，同一批感官測(cè)試者評(píng)定，得到平均得分為(85.39±3.25)分，接近模型預(yù)測(cè)結(jié)果，但由于模型優(yōu)化后的成品感官評(píng)分均比中心點(diǎn)組合試驗(yàn)的感官評(píng)分低，因此選擇原料配比（V/V）為2:1，白糖添加量20%和檸檬酸添加量0.10%為最優(yōu)工藝，平均感官評(píng)分為(90.43±1.07)分。

2.3 微生物指標(biāo)檢測(cè)

復(fù)合飲料中未檢出大腸菌群和金黃色葡萄球菌群，菌落總數(shù)為20 cfu/mL，小于100 cfu/mL，符合GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》的要求。結(jié)果表明，復(fù)合飲料在加工過程中沒有致病菌產(chǎn)生且微生物菌落達(dá)到國家生產(chǎn)飲料要求。

2.4 抗氧化結(jié)果分析

烘焙過程中咖啡中的糖和蛋白質(zhì)、氨基酸等發(fā)生反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生類黑精、酚類等物質(zhì)，增強(qiáng)咖啡液的抗氧化能力[30]。麗江山荊子同樣被報(bào)道，含有較多的多酚、黃酮類抗氧化能力強(qiáng)的物質(zhì)[22]。結(jié)果表明，滅菌后的復(fù)合飲料DPPH自由基清除率達(dá)到了(48.31±0.48)%，ABTS+自由基清除能力達(dá)到了(16.22±0.76) U/mL，說明加工成型的咖啡山荊子復(fù)合飲料具有一定程度的抗氧化活性，具有潛在的對(duì)人體健康有益的作用。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定云南小?？Х壬角G子復(fù)合飲料最佳工藝參數(shù)為咖啡原液∶山荊子果汁添加量（V/V）=2:1，白砂糖添加量=20%，檸檬酸添加量=0.10%，在此參數(shù)下產(chǎn)品感官得分為(90.43±1.07)分。按此工藝所得復(fù)合飲料成品微生物指標(biāo)符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，而且復(fù)合飲料成品滅菌后有 DPPH和 ABTS+自由基清除能力，顯示了一定的抗氧化效果，具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值。