稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik一個(gè)新單倍型的功能鑒定

郭嘉媛 黃健強(qiáng) 吳亦靈 洪永河 陳曉峰

摘 要：稻瘟病菌無毒基因的變異會(huì)導(dǎo)致水稻抗病品種喪失抗性，因此，稻瘟病菌無毒基因變異機(jī)制的研究對(duì)于水稻抗病育種及抗病品種合理布局具有重要指導(dǎo)意義。為了更加全面地了解稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik的變異機(jī)制，對(duì)課題組前期獲得的來自全國各地100多株稻瘟病菌田間菌株中AVR-Pik位點(diǎn)的突變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新單倍型AVR-PikG，其編碼產(chǎn)物含有一個(gè)未見報(bào)道的點(diǎn)突變M58I。進(jìn)一步的功能鑒定結(jié)果顯示，表達(dá)Avr-PikG的稻瘟病菌菌株對(duì)所有供試Pik單基因系水稻均有毒，而表達(dá)Avr-PikDM58I的菌株則對(duì)所有供試Pik單基因系水稻無毒，表明目前所有已知Pik等位基因的編碼產(chǎn)物均無法識(shí)別新單倍型Avr-PikG，而Avr-PikG所含點(diǎn)突變M58I可能與其成功逃避抗病蛋白識(shí)別無關(guān)。

關(guān)鍵詞：稻瘟病菌;無毒基因AVR-Pik;新單倍型;毒性分析

中圖分類號(hào)：S 435?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號(hào)：0253-2301（2022）03-0007-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.03.002

Functional Identification of the Novel Haplotype of Avirulence GeneAVR-Pik in Magnaporthe oryzae

GUO Jia-yuan2， HUANG Jian-qiang2， WU Yi-ling2， HONG Yong-he2， CHEN Xiao-feng1*

（1. College of Geography and Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108， China;

2. College of Plant Protection， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： The variation of avirulence genes （AVR genes） in Magnaporthe oryzae always leads to the breakdown of resistance in disease-resistant rice cultivars. Therefore， the study on the variation mechanism of AVR genes in M. oryzae is of great guiding significance for the breeding and rational utilization of disease-resistant rice cultivars. In order to better understand the variation mechanism of AVR-Pik in M. oryzae， the variation of AVR-Pik locus in more than 100 field isolates of M. oryzae collected from all over the country was analyzed in this study， and a novel haplotype AVR-PikG was identified whose encoding product contains a previously unreported point mutation M58I. Further functional identification results showed that the strains expressing only Avr-PikG were virulent to all tested monogenic lines carrying different Pik alleles， while the strains expressing only Avr-PikDM58I were all avirulent， which demonstrated that Avr-PikG could evade the recognition of all known resistance proteins encoded by different Pik alleles， but the point mutation M58I in Avr-PikG might not be associated with its successful immune evasion.

Key words： Magnaporthe oryzae; Avirulence gene AVR-Pik; Novel haplotype; Virulence analysis

由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病被稱為“水稻癌癥”，嚴(yán)重威脅我國乃至全球的糧食生產(chǎn)安全。在田間，稻瘟病菌無毒基因在水稻抗病基因的選擇壓力下極易發(fā)生突變，而這往往會(huì)導(dǎo)致新推廣的水稻抗病品種在短短幾年間就喪失抗性[1]。換言之，稻瘟病菌無毒基因決定著水稻抗病的持久性，因此，為了實(shí)現(xiàn)稻瘟病的可持續(xù)防控，系統(tǒng)、全面地研究稻瘟病菌無毒基因的變異機(jī)制和規(guī)律就尤為必要，相關(guān)研究也將有益于改進(jìn)水稻抗病育種策略及現(xiàn)有抗病品種的合理布局。

AVR-Pik和Pik是稻瘟病病害系統(tǒng)中一對(duì)具有重要研究意義的無毒基因/抗病基因組合。水稻抗病基因Pik有多個(gè)等位基因位點(diǎn)，如Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7等

[2-8]，在水稻抗病育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值且被廣泛應(yīng)用。而在與水稻長期的互作過程中，稻瘟病菌無毒基因位點(diǎn)AVR-Pik在經(jīng)受來自不同Pik等位基因極強(qiáng)正向選擇壓力的情況下，會(huì)通過不斷形成新的單倍型來逃避抗病基因的免疫識(shí)別。截至目前，科研人員共鑒定出10個(gè)AVR-Pik單倍型，分別為AVR-PikA、AVR-PikB、AVR-PikC、AVR-PikD、AVR-PikE[9]、AVR-PikF[8]以及H06、H07、H08和H09[10]，它們的主要區(qū)別在于第46、47、48、67和78位氨基酸的不同點(diǎn)突變方式。不同AVR-Pik單倍型對(duì)不同Pik等位基因具有識(shí)別的差異性和特異性，具體表現(xiàn)在對(duì)不同單基因系抗病品種的毒性上，例如含有AVR-PikD的菌株對(duì)Pik、Pikm、Pikp、Pikh和Piks等單基因系水稻均無毒，而含有AVR-PikF的菌株則對(duì)這些單基因系水稻都表現(xiàn)出毒性[8]?？梢?，上述5個(gè)氨基酸位點(diǎn)的多態(tài)性決定著與Pik等位基因產(chǎn)物的互作親和力，而這正是在自然選擇壓力下AVR-Pik和Pik之間共進(jìn)化的具體表現(xiàn)形式[11-12]。

為了揭示稻瘟病菌群體遺傳多樣性特點(diǎn)及其產(chǎn)生機(jī)制，本課題組前期對(duì)來自我國各地百余株稻瘟病菌田間菌株進(jìn)行了基因組測序[13]，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)各菌株中無毒基因AVR-Pik位點(diǎn)的突變機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并著重對(duì)鑒定出的一個(gè)新單倍型AVR-PikG進(jìn)行功能鑒定，研究結(jié)果將進(jìn)一步拓展對(duì)稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik變異機(jī)制的認(rèn)知，也將為有針對(duì)性地進(jìn)行水稻抗病育種和抗病品種合理布局提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 稻瘟病菌菌株及單基因系水稻品種

稻瘟病菌菌株R88002不含任何AVR-Pik位點(diǎn)，是本研究中遺傳轉(zhuǎn)化的背景菌株;菌株FJ81278采自福建省，為AVR-PikD的供體;菌株YN08182c收集自云南省，為新單倍型AVR-PikG的供體。用于Avr-Pik位點(diǎn)分析的百余株稻瘟病菌田間菌株為課題組前期收集自黑龍江、北京、江蘇、四川、湖北、浙江、江西、湖南、福建、云南、廣東等地[13]。

水稻單基因系品種Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7為本研究中對(duì)稻瘟病菌菌株進(jìn)行毒性分析時(shí)所使用的供試材料，水稻品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）為感病對(duì)照材料。

1.2 新單倍型AVR-PikG的序列分析

以稻瘟病菌菌株YN08182c侵染階段的總cDNA為模板、使用引物AVR-Pik-OF/OR（引物序列見表1）擴(kuò)增獲得AVR-PikG的全長CDS片段，測序獲得其序列后，使用Clustal X軟件將所得序列的編碼序列與已知10個(gè)Avr-Pik單倍型序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，再用MEGA X軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bootstrap參數(shù)設(shè)置為1000）[14]。

1.3 表達(dá)Avr-PikG及Avr-PikDM58I的稻瘟病菌菌株構(gòu)建

分別以稻瘟病菌菌株YN08182c與FJ81278的基因組DNA為模板、使用引物AVR-Pik-CF/CR擴(kuò)增獲得AVR-PikG與AVR-PikD的基因全長片段，并亞克隆進(jìn)pKNTG載體獲得重組質(zhì)粒pKNTG-AvrPikG與pKNTG-AvrPikD。以菌株FJ81278的基因組DNA為模板、使用引物AVR-Pik-CF/AVR-PikDM-R及AVR-PikDM-F/AVR-Pik-CR擴(kuò)增出含部分重疊區(qū)域且編碼Avr-PikDM58I的兩個(gè)片段，通過重疊延伸PCR技術(shù)將兩個(gè)片段融合之后亞克隆進(jìn)pKNTG載體獲得重組質(zhì)粒pKNTG-AvrPikDM58I。上述3個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定無誤后，借助稻瘟病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的方法[15-16]分別導(dǎo)入菌株R88002，獲得分別表達(dá)Avr-PikG、Avr-PikD及Avr-PikDM58I的菌株。

1.4 表達(dá)Avr-PikG及Avr-PikDM58I菌株的毒性分析

待供試單基因系水稻幼苗長至3葉1心期時(shí)，制備供試菌株的分生孢子懸浮液并調(diào)至濃度為1.0×105 個(gè)·mL-1，采用噴霧接種法進(jìn)行接種。接種后的水稻幼苗先置于23～25℃的保濕筒內(nèi)避光培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)移至24～26℃且高濕的溫室中促進(jìn)發(fā)病，7 d后參考國際水稻葉瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]調(diào)查并記錄供試菌株對(duì)不同供試單基因系水稻的毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 新單倍型AVR-PikG的獲得及其序列分析

為了系統(tǒng)、全面了解稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik的變異機(jī)制，本研究對(duì)前期獲得的100多株來自全國各地的稻瘟病菌田間菌株的全基因組序列中Avr-Pik位點(diǎn)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，有16株菌株具有完整的ORF區(qū)，有12株菌株ORF區(qū)完全缺失，有13株菌株的ORF區(qū)存在大片段缺失或完全缺失（其中3株啟動(dòng)子區(qū)域同時(shí)存在大片段缺失，1株啟動(dòng)子區(qū)域插入一個(gè)POT3轉(zhuǎn)座子，其余9株啟動(dòng)子區(qū)域插入有未知重復(fù)序列）;有1株菌株在ORF區(qū)缺失兩個(gè)堿基、造成移碼突變，且還含有2個(gè)有義點(diǎn)突變和1個(gè)無義點(diǎn)突變;有1株菌株在ORF區(qū)多了兩個(gè)堿基、造成移碼突變，且還含有3個(gè)有義點(diǎn)突變;此外，僅含有3個(gè)有義點(diǎn)突變的菌株共有40株，僅含有2個(gè)有義點(diǎn)突變的菌株有30株，僅含有1個(gè)有義點(diǎn)突變的菌株有4株。鑒定出的點(diǎn)突變位點(diǎn)有H46N、P47A/R、G48D、A67D、M78I/K以及M58I，其中H46、P47、G48、A67及M78為已報(bào)道的突變位點(diǎn)[8-9]，而M58尚未見報(bào)道。因此，將來自云南的菌株YN08182c中含有M58I點(diǎn)突變的Avr-Pik位點(diǎn)命名為Avr-PikG，其與已知Avr-Pik單倍型的序列比對(duì)結(jié)果如圖1A所示，與Avr-PikD相比，Avr-PikG共含有5個(gè)有義突變位點(diǎn)，分別是H46N、P47A、G48D、M58I、M78K;Avr-PikG與最新發(fā)現(xiàn)的Avr-PikF的序列最為相似，僅相差一個(gè)有義突變位點(diǎn)，即M58I。進(jìn)化分析結(jié)果如圖1B所示，Avr-PikG與Avr-PikF的親緣關(guān)系最為接近，它們與其余單倍型一樣都是由Avr-PikD進(jìn)化而來。

2.2 表達(dá)Avr-PikG菌株的毒性分析

為了明確目前所有已知Pik等位基因編碼的抗病蛋白能否識(shí)別Avr-PikG，本研究對(duì)只表達(dá)Avr-PikG的菌株R88002-AvrPikG在含不同Pik等位基因的單基因系水稻上的毒性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示，所有供試菌株對(duì)感病對(duì)照水稻品種LTH均表現(xiàn)有毒，表明所有供試菌株都已成功接種;背景菌株R88002對(duì)所有供試單基因系水稻均有毒，只表達(dá)Avr-PikD的對(duì)照菌株R88002-AvrPikD對(duì)除Piks以外的所有供試單基因系水稻均無毒，而只表達(dá)Avr-PikG的2個(gè)供試菌株R88002-AvrPikG-3與R88002-AvrPikG-6則與背景菌株R88002一樣，對(duì)所有供試單基因系水稻均有毒。這一結(jié)果表明，新單倍型Avr-PikG無法被目前所有已知Pik等位基因編碼的抗病蛋白所識(shí)別。

2.3 表達(dá)Avr-PikDM58I菌株的毒性分析

為了明確M58位點(diǎn)是否與Avr-PikD正常的生物學(xué)功能有關(guān)，本研究對(duì)只含M58I點(diǎn)突變的Avr-PikD菌株R88002-AvrPikDM58I在含不同Pik等位基因的單基因系水稻上的毒性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3所示，所有供試菌株對(duì)感病對(duì)照LTH均有毒，表明所有供試菌株接種成功;只表達(dá)Avr-PikDM58I的兩個(gè)供試菌株R88002-AvrPikDM58I-3、R88002-AvrPikDM58I-11與只表達(dá)Avr-PikD的對(duì)照菌株R88002-AvrPikD一樣，對(duì)除Piks以外的所有供試單基因系水稻均無毒，而背景菌株R88002對(duì)所有供試單基因系水稻均有毒。從毒性鑒定結(jié)果來看，Avr-PikD中第58位甲硫氨酸的單一突變并不會(huì)影響其原有的、對(duì)不同Pik單基因系水稻的毒性。

3 討論與結(jié)論

稻瘟病是世界范圍內(nèi)水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，其病原的田間群體復(fù)雜多樣，因無毒基因突變而引起的毒性變異迅速，使得該病害防治十分棘手。因此，對(duì)稻瘟病菌田間群體開展系統(tǒng)、全面的無毒基因變異機(jī)制研究十分重要，是制定持久有效的稻瘟病生態(tài)防控策略的理論基礎(chǔ)。本研究通過分析100多株收集自全國各地的稻瘟病菌田間菌株中無毒基因AVR-Pik位點(diǎn)的序列變異，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新單倍型AVR-PikG，其編碼產(chǎn)物除了含有已知的H46N、P47A、G48D、M78K等突變位點(diǎn)外，還含有一個(gè)未見研究報(bào)道的點(diǎn)突變M58I。

在成對(duì)被克隆的稻瘟病菌無毒基因和水稻抗病基因組合中，AVR-Pik和Pik是研究稻瘟病菌與水稻共進(jìn)化分子機(jī)制的首選對(duì)象。已有研究發(fā)現(xiàn)，無毒基因單倍型AVR-PikD是進(jìn)化上最原始的，其余單倍型都由它進(jìn)化而來，進(jìn)化的動(dòng)力來源于相應(yīng)抗病基因Pik的選擇壓力，具體表現(xiàn)在決定著與不同Pik等位基因產(chǎn)物互作親和力的五個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，即H46、P47、G48、A67、M78[11-12]。Pik-1和Pik-2是兩個(gè)遺傳連鎖的水稻NLR（nucleotide-binding leucine-rich repeat）受體基因，它們編碼的蛋白功能相對(duì)獨(dú)立卻共同決定著Pik水稻的抗病性[3-5]，其中Pik-1能與Avr-Pik直接互作，Pik-2雖不與Avr-Pik直接互作，卻能與Pik-1互作，這樣一來抗病反應(yīng)信號(hào)通過Pik-1從Avr-Pik傳遞給Pik-2，進(jìn)而激活特異的ETI抗病反應(yīng)[7，18-20]。與典型的NLR蛋白一樣，Pik-1含有保守的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil domain，CC）、重金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域（heavy metal-associated domain，HMA）、NBS-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by Apaf-1， R-protein and CED4）結(jié)構(gòu)域以及富含亮氨酸結(jié)構(gòu)域（leucine-rich repeat domain，LRR），其顯示出較高的序列多態(tài)性，且許多多態(tài)性位點(diǎn)聚集在與Avr-Pik發(fā)生互作的HMA結(jié)構(gòu)域;而Pik-2只含有CC結(jié)構(gòu)域、NBS-ARC結(jié)構(gòu)域以及LRR結(jié)構(gòu)域，其序列多態(tài)性水平較低

[18-19]。此外，科研人員通過對(duì)Pikp-1、Pikm-1與不同Avr-Pik單倍型的互作晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析明確了Pikp、Pikm的HMA結(jié)構(gòu)域和Avr-PikD的互作主要發(fā)生在3個(gè)界面上，而Avr-PikD在這3個(gè)互作界面中的任何一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變化都會(huì)影響其與Pikp-1、Pikm-1之間的相互作用[19]。

本研究通過一系列毒性分析試驗(yàn)證實(shí)，目前所有已知Pik等位基因，即Pik、Pikm、Pikp、Pikh、Piks、Pi1、Pi7的編碼產(chǎn)物均無法識(shí)別新單倍型Avr-PikG，但第58位甲硫氨酸的突變并不會(huì)影響Avr-PikD原有的、對(duì)不同Pik等位基因產(chǎn)物的互作親和力。因此推斷，在Avr-PikG所含點(diǎn)突變中，H46N、P47A、G48D及M78K與其毒性功能密切相關(guān)，而第58位甲硫氨酸并不位于已知的、與Pik-1的互作界面上，因此，單一的M58I點(diǎn)突變可能不足以改變其與相應(yīng)抗病蛋白的互作親和力。至于M58I點(diǎn)突變的生物學(xué)意義仍有待進(jìn)一步研究揭示。

參考文獻(xiàn)：

[1]LEACH J E，CRUZ C M V，BAI J F，et al.Pathogen fitness penalty as a predictor of durability of disease resistance genes[J].Annual Review of Phytopathology，2001，39（1）： 87-224.

[2]CAMPBELL M A，CHEN D，RONALD P C.Development of co-dominant amplified polymorphic sequence markers in rice that flank the Magnaporthe grisea resistance gene Pi7（t）

in recombinant inbred line 29[J]. Phytopathology， 2004， 94（3）： 302-307.

[3]ASHIKAWA I， HAYASHI N， YAMANE H， et al. Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance[J]. Genetics， 2008， 180（4）： 2267-2276.

[4]YUAN B， ZHAI C， WANG W， et al. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes[J].Theoretical and Applied Genetics， 2011，122（5）： 1017-1028.

[5]ZHAI C， LIN F， DONG Z， et al. The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication[J]. New Phytologist， 2011， 189（1）： 321-334.

[6]HUA L， WU J， CHEN C， et al. The isolation of Pi1， an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2012， 125（5）： 1047-1055.

[7]ZHAI C， ZHANG Y， YAO N， et al. Function and interaction of the coupled genes responsible for Pik-h encoded rice blast resistance[J]. PLoS One， 2014， 9（6）： e98067.

[8]LONGYA A， CHAIPANYA C， FRANCESCHETTI M， et al. Gene duplication and mutation in the emergence of a novel aggressive allele of the AVR-Pik effector in the rice blast fungus[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2019， 32（6）： 740-749.

[9]YOSHIDA K， SAITOH H， FUJISAWA S， et al. Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae[J]. Plant Cell， 2009， 21（5）： 1573-1591.

[10]LI J， WANG Q， LI C， et al. Novel haplotypes and networks of AVR-Pik alleles in Magnaporthe oryzae[J]. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 204-215.

[11]KANZAKI H， YOSHIDA K， SAITOH H， et al. Arms race co-evolution of Magnaporthe oryzae AVR-Pik and rice Pik genes driven by their physical interactions[J]. Plant Journal， 2012， 72（6）： 894-907.

[12]WU W， WANG L， ZHANG S， et al. Stepwise arms race between AvrPik and Pik alleles in the rice blast pathosystems[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2014， 27（8）： 759-769.

[13]ZHONG Z， CHEN M， LIN L， et al. Population genomic analysis of the rice blast fungus reveals specific events associated with expansion of three main clades[J]. ISME Journal， 2018， 12（8）：1867-1878.

[14]KUMAR S， STECHER G， LI M， et al. MEGA X： Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms[J]. Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）：1547-1549.

[15]SWEIGARD J A， CHUMLEY F G， VALENT B. Disruption of a Magnaporthe grisea cutinase gene[J]. Molecular and General Genetics， 1992， 232（2）： 183-190.

[16]SWEIGARD J A CARROLL A M， FARRALL L， et al. Magnaporthe grisea pathogenicity genes obtained through insertional mutagenesis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 1998， 11（5）： 404-412.

[17]VALENT B， FARRALL L， CHUMLEY F G. Magnaporthe grisea genes for pathogenicity and virulence identified through a series of backcrosses[J]. Genetics， 1991， 127（1）： 87-101.

[18]MAQBOOL A， SAITOH H， FRANCESCHETTI M， et al. Structural basis of pathogen recognition by an integrated HMA domain in a plant NLR immune receptor[J]. Elife， 2015， 4： e08709.

[19]DE LA CONCEPCION J C， FRANCESCHETTI M， MAQBOOL A， et al. Polymorphic residues in rice NLRs expand binding and response to effectors of the blast pathogen[J]. Nature Plants， 2018， 4（8）： 576-585.

[20]ZDRZA EK R， KAMOUN S， TERAUCHI R， et al. The rice NLR pair Pikp-1/Pikp-2 initiates cell death through receptor cooperation rather than negative regulation[J]. PLoS One， 2020， 15（9）： e0238616.

（責(zé)任編輯：柯文輝）