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    利用大孔樹脂分離靈芝菌絲體中水溶性抗氧化成分

    2022-05-17 07:06:22鄭丹婷姚澤遠(yuǎn)卜原玲
    關(guān)鍵詞:水提液菌絲體大孔

    韓 偉,鄭丹婷,姚澤遠(yuǎn),卜原玲,馮 杰

    (1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 a.制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心,b.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

    氧自由基的不斷積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)氧化,造成DNA、蛋白質(zhì)和生物膜的損傷,繼而引發(fā)許多重大疾病,如:動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥等[1],因此抗氧化劑的開發(fā)對于上述疾病的預(yù)防具有重要意義.曾被大量使用的化學(xué)合成抗氧化劑,如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有一定的毒性和致畸作用[2],故安全、低毒的天然抗氧化劑開發(fā)成為了學(xué)者研究熱門課題.

    靈芝(Ganodermalucidum)是我國傳統(tǒng)名貴藥用真菌之一,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)靈芝中粗多糖[3]、三萜[4]、甾醇[5]、蛋白質(zhì)[6]、生物堿[7]等物質(zhì),均具有一定的抗氧化活性.野生靈芝受地域、季節(jié)、原料等因素的影響,品質(zhì)較差、生長周期長且成本較高[8].靈芝菌絲體為靈芝營養(yǎng)體的基本結(jié)構(gòu),可通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)快速獲得,且可以通過對培養(yǎng)條件的調(diào)整,得到含有更多目標(biāo)成分(如三萜、生物堿、氨基酸等)的菌絲體[9-11],使得靈芝天然抗氧化劑的開發(fā)成為可能.

    大孔樹脂憑借其高選擇性、易解吸、低能耗以及目標(biāo)產(chǎn)物活性不被破壞等優(yōu)勢在天然產(chǎn)物分離中得到廣泛應(yīng)用.本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[12],以DPPH清除率、ABTS清除率和羥自由基清除率為評價(jià)指標(biāo),采用大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液(Ganoderma lucidum mycelium water extraction,GLMw)中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行分離,并對大孔樹脂分離前后物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行比較.

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    靈芝菌絲體樣品,由上海市農(nóng)科院食用菌所提供.

    ABTS,上海畢得醫(yī)藥科技有限公司;過硫酸鉀、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;DPPH,上海耐澄生物科技有限公司;無水乙醇,上海泰坦化學(xué)有限公司;X-5、D-101、AB-8、NKA-9大孔樹脂,天津浩聚樹脂科技有限公司;DM-130、HPD-400大孔樹脂,鄭州和成新材料科技有限公司;DM-301大孔樹脂,羅恩試劑;S-8大孔樹脂,北京索萊寶科技有限公司.

    UV1900紫外-可見光分光光度計(jì),上海亞研電子科技有限公司;AL104分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;LCD-SK5210HP功率可調(diào)臺(tái)式加熱系列超聲儀,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;RE-2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海予華儀器設(shè)備有限公司;PHS-25 pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器有限公司.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 靈芝菌絲體濃縮液的制備

    根據(jù)課題組前期研究的結(jié)果[12],確定靈芝菌絲體濃縮液制備方式如下:

    分別稱取5份靈芝菌絲體樣品粉末各1.0 g,于圓底燒瓶中,按液固比50∶1各加入50 mL去離子水,搖勻,充分浸潤5 min后,于50 ℃、156 W的條件下超聲提取60 min.抽濾后將濾液濃縮合并,得到靈芝菌絲體濃縮液.

    1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理

    表1表示出了不同型號大孔樹脂的性能指標(biāo),取適量不同型號的大孔樹脂,分別于100 mL錐形瓶中,用95%乙醇浸泡24 h,除去上浮的碎片和雜物后濕法裝柱.95%乙醇洗至流出液無渾濁后,用去離子水將樹脂洗至無乙醇味.用5% NaOH浸泡4 h后,水洗至pH=7,再用5% HCl浸泡4 h,水洗至pH=7.將處理好的大孔樹脂用去離子水密封置于冰箱保存,備用.

    表1 不同型號大孔樹脂的性能指標(biāo)

    1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

    1)大孔樹脂的篩選

    ①將1.2.1制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋為5 mg/mL的樣品溶液,由于靈芝菌絲體濃縮液為混合物,為使不同溶液的體外抗氧化活性具有比較意義,此處參考蔡夢婷等[13]的表述方法,將待測物表示為每毫升提取液中含有的原材料質(zhì)量(如5 mg/mL表示為5 mg靈芝菌絲體原材料經(jīng)提取和大孔樹脂分離等操作后得到1 mL溶液,下同).

    ②量取1.2.2中經(jīng)預(yù)處理得到的大孔樹脂各50 mL于100 mL錐形瓶中,向每個(gè)瓶中各加入上述水提液50 mL,蓋上塞子,在室溫下吸附12 h,待吸附充分后抽濾,將濾液濃縮后定容至25 mL容量瓶,稀釋10倍后測定水提液經(jīng)各大孔樹脂吸附后的體外抗氧化活性.

    ③抽濾后的大孔樹脂用少量去離子水洗滌后,分別用50 mL 95%乙醇轉(zhuǎn)移至錐形瓶,蓋上塞子后在室溫下解吸16 h,然后進(jìn)行抽濾,抽濾后的大孔樹脂進(jìn)行再生處理,將濾液中的乙醇旋干后用去離子水定容至25 mL,稀釋10倍后測定解吸后各樣品溶液的體外抗氧化活性.

    2)上樣質(zhì)量濃度的篩選

    將1.2.1中制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋為50 mg/mL的樣品溶液后,再分別稀釋至1、2、4、6、8、10、15、20、30、40、50 mg/mL各25 mL的靈芝菌絲體水提液.按1.2.2對篩選得到的大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理,量取15 mL預(yù)處理好的大孔樹脂11份分別于錐形瓶中,并分別加入各質(zhì)量濃度的提取液,蓋上塞子,在室溫下吸附12 h,吸附充分后抽濾,將濾液分別稀釋至1 mg/mL,測定未被吸附溶液的體外抗氧化活性.

    抽濾后的大孔樹脂用少量去離子水清洗后,分別用50 mL 95%乙醇轉(zhuǎn)移至錐形瓶,蓋上塞子后在室溫下解吸16 h并進(jìn)行抽濾,抽濾后的大孔樹脂進(jìn)行再生處理,將濾液中的乙醇旋蒸除去后用去離子水稀釋至1 mg/mL,測定解吸后各樣品溶液的抗氧化活性.

    1.2.4 大孔樹脂動(dòng)態(tài)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)

    量取經(jīng)過預(yù)處理篩選得到的大孔樹脂50 mL,濕法裝入2 cm×50 cm的樹脂柱中(樹脂柱中預(yù)先裝入適量去離子水),裝柱時(shí)不斷敲擊樹脂柱,使大孔樹脂均勻緊密沉降,將過量的水從下端放出.上樣時(shí),沿樹脂柱內(nèi)壁緩慢加入靈芝菌絲體水提液,為防止樹脂頂層浮起,在樹脂層上方放置一塊適宜大小的濾紙.

    1)上樣體積的選擇

    將1.2.1制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋至10 mg/mL,沿樹脂柱內(nèi)壁將溶液緩緩添加到樹脂柱中,控制流速為2 BV/h,同時(shí)在樹脂柱下方出口接收流出液,每10 mL收集一份,共30份.將收集得到的流出液適當(dāng)合并成15份,每份流出液稀釋5倍,測定其DPPH、ABTS和羥自由基清除率,判斷大孔樹脂的最大上樣體積.

    2)洗脫液體積分?jǐn)?shù)的選擇

    向含有50 mL篩選得到的大孔樹脂的樹脂柱中緩慢加入10 mg/mL的靈芝菌絲體水提液100 mL,隨后用100 mL去離子水洗滌大孔樹脂,除去未被吸附的物質(zhì),隨后依次用體積分?jǐn)?shù)梯度為30%、50%、70%、95%的乙醇各200 mL對樹脂柱進(jìn)行洗脫,收集各部分洗脫液并將乙醇旋干,用去離子水溶解各部分的洗脫物,配置成2 mg/mL的待測液,測定各部分待測液的抗氧化活性.

    1.2.5 大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    1)靈芝菌絲體水提液樣品制備

    精密稱取靈芝菌絲體樣品1.0 g,加入50 mL去離子水,浸潤5 min后,在超聲條件50 ℃、156 W下提取60 min,溶液放冷后進(jìn)行抽濾,重復(fù)提取4份,將濾液合并后蒸去溶劑,得到靈芝菌絲體水提液浸膏,將浸膏于55 ℃條件下烘干,研磨成粉末,備用.

    2)大孔樹脂洗脫液樣品制備

    精密稱取靈芝菌絲體樣品1.0 g,加入50 mL去離子水,浸潤5 min后,在超聲條件50 ℃、156 W下提取60 min,溶液放冷后進(jìn)行抽濾,重復(fù)提取4份,將濾液合并后,稀釋至10 mg/mL,根據(jù)確定的大孔樹脂最佳吸附和解吸方法,收集洗脫液,旋蒸除去溶劑,得到大孔樹脂洗脫液浸膏,將浸膏于55 ℃條件下烘干,研磨成粉末,備用.

    3)大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    將1.2.5中1)和2)制備的不同樣品稀釋成適宜體積分?jǐn)?shù)梯度的待測液,分別測定DPPH、ABTS和羥自由基清除率,計(jì)算經(jīng)大孔樹脂吸附處理前后樣品對不同自由基清除率的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(EC50),對比抗氧化活性的變化.

    1.2.6 抗氧化檢測方法

    1)DPPH自由基清除率

    參考文獻(xiàn)[14]的方法,本文改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟如下:稱取DPPH粉末12.5 mg,用乙醇(95%)溶解,定容至100 mL,將所得0.031 7 mmol/L的DPPH自由基儲(chǔ)備液避光保存.使用時(shí)稀釋5倍,使其吸光度為0.7左右,得到DPPH自由基工作溶液.測量時(shí),取樣品溶液2 mL于5 mL棕色容量瓶,加入2 mL DPPH自由基工作溶液后搖勻,避光反應(yīng)30 min后用紫外-可見光分光光度計(jì)于517 nm處測定吸光度,用95%乙醇調(diào)零.按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率(S1),重復(fù)3次,取平均值.

    (1)

    其中:Ai為樣品溶液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度,Aj為用95%乙醇代替DPPH溶液測得樣品溶液的本底吸光度,A0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    2)羥自由基清除率

    采用水楊酸法測定提取液的羥自由基清除率,參考文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn).在10 mL具塞試管中依次加入1 mL樣品溶液、1 mL 9 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2溶液,室溫下靜置10 min,再向試管中移入1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,混合均勻后在37 ℃水浴條件下保溫30 min,離心后檢測上清液在510 nm處的吸光度,用去離子水調(diào)零.羥自由基清除率(S2)計(jì)算方法如式(2),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值.

    (2)

    其中:A′i為樣品溶液與水楊酸體系反應(yīng)后的吸光度,A′j為用去離子水代替H2O2測得樣品溶液的本底吸光度,A′0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    3)ABTS自由基清除率

    參考IlSasov等[16]的方法并加以改進(jìn).移取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和100 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液于10 mL棕色容量瓶中,搖勻后避光反應(yīng)12~16 h,用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋90倍左右,使其吸光度為0.7附近,得到ABTS自由基溶液.取樣品溶液1 mL于5 mL棕色容量瓶,加入4 mL ABTS自由基溶液后搖勻,避光反應(yīng)6 min后測定溶液在734 nm的吸光度.按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率(S3),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值.

    (3)

    其中:A″i為樣品溶液與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光度,A″j為用磷酸鹽緩沖液代替ABTS測得樣品溶液的本底吸光度,A″0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 大孔樹脂的篩選

    各型號大孔樹脂在靜態(tài)條件下對5 mg/mL 靈芝菌絲體水提液的吸附和解吸情況如表2所示,為直觀對比各種樹脂的性能,繪制柱狀圖(圖1).

    表2 不同型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液的吸附與解吸情況

    如圖1所示,從羥自由基清除效果來看,大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物抗氧化活性物質(zhì)的吸附能力較弱;對于DPPH·和ABTS+·清除法來說,除S-8大孔樹脂外,其余型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物的抗氧化活性成分均具有較好的吸附能力.為了全面評價(jià)各型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物抗氧化活性物質(zhì)的吸附與解吸能力,對表2中解吸后的自由基清除率(S1、S2、S3)進(jìn)行正向歸一化處理(式(4)),對未被吸附(即上清液)的自由基清除率(S′1、S′2、S′3)進(jìn)行反向歸一化處理(式(5)),隨后按熵權(quán)法[17]求取各指標(biāo)權(quán)重.

    (4)

    (5)

    利用熵權(quán)法對評價(jià)指標(biāo)S1、S2、S3、S′1、S′2、S′3各自所占的權(quán)重進(jìn)行計(jì)算.以表2中的8組數(shù)據(jù)為樣本,首先對Sij進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化得到y(tǒng)ij后,按式(6)計(jì)算信息熵Ej,按式(7)計(jì)算權(quán)重wj.

    (6)

    (7)

    定義加權(quán)后的綜合抗氧化活性為Z,其計(jì)算方法如下:

    (8)

    圖1 各型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液的吸附與解吸情況

    各型號大孔樹脂的綜合吸附-解吸能力如表3所示.結(jié)果表明,HPD-400和X-5大孔樹脂的綜合評分相近并明顯高于其它大孔樹脂,且HPD-400在DPPH法和ABTS法中明顯優(yōu)于X-5大孔樹脂,因此選擇中等極性HPD-400大孔樹脂進(jìn)行后續(xù)靈芝菌絲體水提液抗氧化活性物質(zhì)的分離.

    表3 各型號大孔樹脂的吸附-解吸能力綜合評分

    2.1.2 上樣質(zhì)量濃度的確定

    不同上樣質(zhì)量濃度下HPD-400大孔樹脂的吸附與解吸情況分別如圖2~3所示.

    圖2 不同質(zhì)量濃度上樣液吸附后溶液的體外抗氧化活性

    圖3 不同質(zhì)量濃度上樣液洗脫后的體外抗氧化活性

    從圖2可以看出,隨著上樣質(zhì)量濃度的增加,吸附后溶液的自由基清除率逐漸升高,由此推測未經(jīng)大孔樹脂吸附的抗氧化活性成分逐漸增多.而圖3則說明了大孔樹脂對于水提液抗氧化活性成分的解吸情況,即當(dāng)上樣質(zhì)量濃度小于10 mg/mL時(shí),解吸液的體外抗氧化活性持續(xù)上升;上樣質(zhì)量濃度在10~20 mg/mL內(nèi),解吸液的體外抗氧化活性趨于平緩,說明在該上樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi),大孔樹脂的吸附性能達(dá)到飽和;上樣質(zhì)量濃度大于20 mg/mL以后,解吸液的活性顯著下降,這是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的上樣液黏度較大,且包含很多雜質(zhì),使得大孔樹脂的吸附能力受到影響,導(dǎo)致泄漏點(diǎn)提前出現(xiàn).

    綜上所述,考慮到吸附效率以及后續(xù)稀釋的難易,選擇10 mg/mL為最佳上樣質(zhì)量濃度.

    2.2 大孔樹脂動(dòng)態(tài)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)

    2.2.1 上樣體積的選擇

    不同上樣體積流出液抗氧化活性折線圖如圖4所示,對于DPPH·和ABTS+·清除法來說,上樣體積低于100 mL時(shí),從樹脂柱下口流出溶液的自由基清除率隨體積逐漸增加,100 mL以后自由基清除率幾乎平穩(wěn)并接近原始提取液的活性.而對于羥自由基清除法來說,上樣體積為40 mL時(shí)吸附便已趨于飽和,這可能是因?yàn)榇罂讟渲旧韺τ谀軌蚯宄u自由基的化合物的吸附性較差,因此較少的上樣體積即可使大孔樹脂對于具有羥自由基清除效果的化合物的吸附達(dá)到飽和.綜合考慮,確定最大上樣體積為100 mL,即2 BV的10 mg/mL的靈芝菌絲體水提液.

    圖4 不同上樣體積流出液的抗氧化活性

    2.2.2 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的選擇

    考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液的體外抗氧化活性,繪制直方圖如圖5所示,從圖中可以直觀看出:靈芝菌絲體水提物被HPD-400大孔樹脂吸附的絕大部分抗氧化活性成分都能被30%的乙醇洗脫下來,其在ABTS+·清除法中體現(xiàn)得最為明顯,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,洗脫物的抗氧化活性逐漸下降.對于羥自由基清除法來說,由于本身被吸附的具有羥自由基清除功能的物質(zhì)就比較少,因此30%乙醇洗脫物的羥自由基清除率雖大于其他組分,但總體差別沒有DPPH法和ABTS法顯著.綜上,選擇30%乙醇洗脫部位進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步分離.

    圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫的洗脫液抗氧化活性

    2.3 大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    表4為靈芝菌絲體水提液經(jīng)大孔樹脂吸附處理前后,在不同體積分?jǐn)?shù)下對不同自由基清除效果的擬合曲線及EC50值.

    表4 大孔樹脂吸附前后的自由基清除效果比較

    將待測物在不同評價(jià)方法下的EC50制成直方圖進(jìn)行對比,見圖6.如圖6所示,經(jīng)大孔樹脂處理后的水提液清除DPPH·和ABTS+·的能力有了明顯提高,對DPPH·的清除能力提高了1倍,ABTS+·清除能力為原始水提液的4倍.但對于羥自由基清除法來說,經(jīng)大孔樹脂處理后的30%乙醇洗脫液的EC50升高到了原來的2.13倍,進(jìn)一步說明了羥自由基法和DPPH及ABTS法所針對化合物的抗氧化機(jī)理有所不同,且中等極性大孔樹脂分離得到的物質(zhì)羥自由基清除能力較差,但有著很高的清除DPPH·和ABTS+·的能力.與Wang等[18]有關(guān)桑樹槲皮素提取物的研究一致:經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的桑樹槲皮素提取物DPPH自由基清除率高于提取液,但羥自由基的清除率有所下降.

    圖6 不同評價(jià)方法的EC50對比

    3 結(jié)論

    以DPPH、ABTS和羥自由基清除率為評價(jià)指標(biāo),利用大孔樹脂吸附靈芝菌絲體水提液中抗氧化活性成分,研究發(fā)現(xiàn)大孔樹脂對可清除DPPH·和ABTS+·的物質(zhì)吸附效果較好,吸附可清除羥自由基的物質(zhì)效果較差,中極性的HPD-400大孔樹脂對具有目標(biāo)活性的化合物吸附效果最佳.用不同梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇對吸附完全的HPD-400大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫,發(fā)現(xiàn)30%乙醇洗脫部位的抗氧化活性明顯高于其他部位,對比30%乙醇洗脫物與靈芝菌絲體水提物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)大孔樹脂分離得到的物質(zhì)能夠有效提高對DPPH·和ABTS+·的清除效果,其中DPPH·清除效果提高1倍,ABTS+·清除效果提高3倍,但清除羥自由基的能力有所降低.

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