• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用大孔樹脂分離靈芝菌絲體中水溶性抗氧化成分

    2022-05-17 07:06:22鄭丹婷姚澤遠(yuǎn)卜原玲
    關(guān)鍵詞:水提液菌絲體大孔

    韓 偉,鄭丹婷,姚澤遠(yuǎn),卜原玲,馮 杰

    (1.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 a.制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心,b.上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200237;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

    氧自由基的不斷積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)氧化,造成DNA、蛋白質(zhì)和生物膜的損傷,繼而引發(fā)許多重大疾病,如:動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥等[1],因此抗氧化劑的開發(fā)對于上述疾病的預(yù)防具有重要意義.曾被大量使用的化學(xué)合成抗氧化劑,如二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有一定的毒性和致畸作用[2],故安全、低毒的天然抗氧化劑開發(fā)成為了學(xué)者研究熱門課題.

    靈芝(Ganodermalucidum)是我國傳統(tǒng)名貴藥用真菌之一,現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)靈芝中粗多糖[3]、三萜[4]、甾醇[5]、蛋白質(zhì)[6]、生物堿[7]等物質(zhì),均具有一定的抗氧化活性.野生靈芝受地域、季節(jié)、原料等因素的影響,品質(zhì)較差、生長周期長且成本較高[8].靈芝菌絲體為靈芝營養(yǎng)體的基本結(jié)構(gòu),可通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)快速獲得,且可以通過對培養(yǎng)條件的調(diào)整,得到含有更多目標(biāo)成分(如三萜、生物堿、氨基酸等)的菌絲體[9-11],使得靈芝天然抗氧化劑的開發(fā)成為可能.

    大孔樹脂憑借其高選擇性、易解吸、低能耗以及目標(biāo)產(chǎn)物活性不被破壞等優(yōu)勢在天然產(chǎn)物分離中得到廣泛應(yīng)用.本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[12],以DPPH清除率、ABTS清除率和羥自由基清除率為評價(jià)指標(biāo),采用大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液(Ganoderma lucidum mycelium water extraction,GLMw)中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行分離,并對大孔樹脂分離前后物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行比較.

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    靈芝菌絲體樣品,由上海市農(nóng)科院食用菌所提供.

    ABTS,上海畢得醫(yī)藥科技有限公司;過硫酸鉀、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;DPPH,上海耐澄生物科技有限公司;無水乙醇,上海泰坦化學(xué)有限公司;X-5、D-101、AB-8、NKA-9大孔樹脂,天津浩聚樹脂科技有限公司;DM-130、HPD-400大孔樹脂,鄭州和成新材料科技有限公司;DM-301大孔樹脂,羅恩試劑;S-8大孔樹脂,北京索萊寶科技有限公司.

    UV1900紫外-可見光分光光度計(jì),上海亞研電子科技有限公司;AL104分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;LCD-SK5210HP功率可調(diào)臺(tái)式加熱系列超聲儀,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司;H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;RE-2010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海予華儀器設(shè)備有限公司;PHS-25 pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器有限公司.

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 靈芝菌絲體濃縮液的制備

    根據(jù)課題組前期研究的結(jié)果[12],確定靈芝菌絲體濃縮液制備方式如下:

    分別稱取5份靈芝菌絲體樣品粉末各1.0 g,于圓底燒瓶中,按液固比50∶1各加入50 mL去離子水,搖勻,充分浸潤5 min后,于50 ℃、156 W的條件下超聲提取60 min.抽濾后將濾液濃縮合并,得到靈芝菌絲體濃縮液.

    1.2.2 大孔樹脂的預(yù)處理

    表1表示出了不同型號大孔樹脂的性能指標(biāo),取適量不同型號的大孔樹脂,分別于100 mL錐形瓶中,用95%乙醇浸泡24 h,除去上浮的碎片和雜物后濕法裝柱.95%乙醇洗至流出液無渾濁后,用去離子水將樹脂洗至無乙醇味.用5% NaOH浸泡4 h后,水洗至pH=7,再用5% HCl浸泡4 h,水洗至pH=7.將處理好的大孔樹脂用去離子水密封置于冰箱保存,備用.

    表1 不同型號大孔樹脂的性能指標(biāo)

    1.2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

    1)大孔樹脂的篩選

    ①將1.2.1制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋為5 mg/mL的樣品溶液,由于靈芝菌絲體濃縮液為混合物,為使不同溶液的體外抗氧化活性具有比較意義,此處參考蔡夢婷等[13]的表述方法,將待測物表示為每毫升提取液中含有的原材料質(zhì)量(如5 mg/mL表示為5 mg靈芝菌絲體原材料經(jīng)提取和大孔樹脂分離等操作后得到1 mL溶液,下同).

    ②量取1.2.2中經(jīng)預(yù)處理得到的大孔樹脂各50 mL于100 mL錐形瓶中,向每個(gè)瓶中各加入上述水提液50 mL,蓋上塞子,在室溫下吸附12 h,待吸附充分后抽濾,將濾液濃縮后定容至25 mL容量瓶,稀釋10倍后測定水提液經(jīng)各大孔樹脂吸附后的體外抗氧化活性.

    ③抽濾后的大孔樹脂用少量去離子水洗滌后,分別用50 mL 95%乙醇轉(zhuǎn)移至錐形瓶,蓋上塞子后在室溫下解吸16 h,然后進(jìn)行抽濾,抽濾后的大孔樹脂進(jìn)行再生處理,將濾液中的乙醇旋干后用去離子水定容至25 mL,稀釋10倍后測定解吸后各樣品溶液的體外抗氧化活性.

    2)上樣質(zhì)量濃度的篩選

    將1.2.1中制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋為50 mg/mL的樣品溶液后,再分別稀釋至1、2、4、6、8、10、15、20、30、40、50 mg/mL各25 mL的靈芝菌絲體水提液.按1.2.2對篩選得到的大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理,量取15 mL預(yù)處理好的大孔樹脂11份分別于錐形瓶中,并分別加入各質(zhì)量濃度的提取液,蓋上塞子,在室溫下吸附12 h,吸附充分后抽濾,將濾液分別稀釋至1 mg/mL,測定未被吸附溶液的體外抗氧化活性.

    抽濾后的大孔樹脂用少量去離子水清洗后,分別用50 mL 95%乙醇轉(zhuǎn)移至錐形瓶,蓋上塞子后在室溫下解吸16 h并進(jìn)行抽濾,抽濾后的大孔樹脂進(jìn)行再生處理,將濾液中的乙醇旋蒸除去后用去離子水稀釋至1 mg/mL,測定解吸后各樣品溶液的抗氧化活性.

    1.2.4 大孔樹脂動(dòng)態(tài)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)

    量取經(jīng)過預(yù)處理篩選得到的大孔樹脂50 mL,濕法裝入2 cm×50 cm的樹脂柱中(樹脂柱中預(yù)先裝入適量去離子水),裝柱時(shí)不斷敲擊樹脂柱,使大孔樹脂均勻緊密沉降,將過量的水從下端放出.上樣時(shí),沿樹脂柱內(nèi)壁緩慢加入靈芝菌絲體水提液,為防止樹脂頂層浮起,在樹脂層上方放置一塊適宜大小的濾紙.

    1)上樣體積的選擇

    將1.2.1制備的靈芝菌絲體濃縮液稀釋至10 mg/mL,沿樹脂柱內(nèi)壁將溶液緩緩添加到樹脂柱中,控制流速為2 BV/h,同時(shí)在樹脂柱下方出口接收流出液,每10 mL收集一份,共30份.將收集得到的流出液適當(dāng)合并成15份,每份流出液稀釋5倍,測定其DPPH、ABTS和羥自由基清除率,判斷大孔樹脂的最大上樣體積.

    2)洗脫液體積分?jǐn)?shù)的選擇

    向含有50 mL篩選得到的大孔樹脂的樹脂柱中緩慢加入10 mg/mL的靈芝菌絲體水提液100 mL,隨后用100 mL去離子水洗滌大孔樹脂,除去未被吸附的物質(zhì),隨后依次用體積分?jǐn)?shù)梯度為30%、50%、70%、95%的乙醇各200 mL對樹脂柱進(jìn)行洗脫,收集各部分洗脫液并將乙醇旋干,用去離子水溶解各部分的洗脫物,配置成2 mg/mL的待測液,測定各部分待測液的抗氧化活性.

    1.2.5 大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    1)靈芝菌絲體水提液樣品制備

    精密稱取靈芝菌絲體樣品1.0 g,加入50 mL去離子水,浸潤5 min后,在超聲條件50 ℃、156 W下提取60 min,溶液放冷后進(jìn)行抽濾,重復(fù)提取4份,將濾液合并后蒸去溶劑,得到靈芝菌絲體水提液浸膏,將浸膏于55 ℃條件下烘干,研磨成粉末,備用.

    2)大孔樹脂洗脫液樣品制備

    精密稱取靈芝菌絲體樣品1.0 g,加入50 mL去離子水,浸潤5 min后,在超聲條件50 ℃、156 W下提取60 min,溶液放冷后進(jìn)行抽濾,重復(fù)提取4份,將濾液合并后,稀釋至10 mg/mL,根據(jù)確定的大孔樹脂最佳吸附和解吸方法,收集洗脫液,旋蒸除去溶劑,得到大孔樹脂洗脫液浸膏,將浸膏于55 ℃條件下烘干,研磨成粉末,備用.

    3)大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    將1.2.5中1)和2)制備的不同樣品稀釋成適宜體積分?jǐn)?shù)梯度的待測液,分別測定DPPH、ABTS和羥自由基清除率,計(jì)算經(jīng)大孔樹脂吸附處理前后樣品對不同自由基清除率的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(EC50),對比抗氧化活性的變化.

    1.2.6 抗氧化檢測方法

    1)DPPH自由基清除率

    參考文獻(xiàn)[14]的方法,本文改進(jìn)實(shí)驗(yàn)步驟如下:稱取DPPH粉末12.5 mg,用乙醇(95%)溶解,定容至100 mL,將所得0.031 7 mmol/L的DPPH自由基儲(chǔ)備液避光保存.使用時(shí)稀釋5倍,使其吸光度為0.7左右,得到DPPH自由基工作溶液.測量時(shí),取樣品溶液2 mL于5 mL棕色容量瓶,加入2 mL DPPH自由基工作溶液后搖勻,避光反應(yīng)30 min后用紫外-可見光分光光度計(jì)于517 nm處測定吸光度,用95%乙醇調(diào)零.按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率(S1),重復(fù)3次,取平均值.

    (1)

    其中:Ai為樣品溶液與DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度,Aj為用95%乙醇代替DPPH溶液測得樣品溶液的本底吸光度,A0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    2)羥自由基清除率

    采用水楊酸法測定提取液的羥自由基清除率,參考文獻(xiàn)[15]并加以改進(jìn).在10 mL具塞試管中依次加入1 mL樣品溶液、1 mL 9 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2溶液,室溫下靜置10 min,再向試管中移入1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,混合均勻后在37 ℃水浴條件下保溫30 min,離心后檢測上清液在510 nm處的吸光度,用去離子水調(diào)零.羥自由基清除率(S2)計(jì)算方法如式(2),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值.

    (2)

    其中:A′i為樣品溶液與水楊酸體系反應(yīng)后的吸光度,A′j為用去離子水代替H2O2測得樣品溶液的本底吸光度,A′0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    3)ABTS自由基清除率

    參考IlSasov等[16]的方法并加以改進(jìn).移取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和100 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液于10 mL棕色容量瓶中,搖勻后避光反應(yīng)12~16 h,用pH=7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋90倍左右,使其吸光度為0.7附近,得到ABTS自由基溶液.取樣品溶液1 mL于5 mL棕色容量瓶,加入4 mL ABTS自由基溶液后搖勻,避光反應(yīng)6 min后測定溶液在734 nm的吸光度.按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率(S3),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值.

    (3)

    其中:A″i為樣品溶液與ABTS溶液反應(yīng)后的吸光度,A″j為用磷酸鹽緩沖液代替ABTS測得樣品溶液的本底吸光度,A″0為以去離子水代替樣品溶液的空白吸光度.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

    2.1.1 大孔樹脂的篩選

    各型號大孔樹脂在靜態(tài)條件下對5 mg/mL 靈芝菌絲體水提液的吸附和解吸情況如表2所示,為直觀對比各種樹脂的性能,繪制柱狀圖(圖1).

    表2 不同型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液的吸附與解吸情況

    如圖1所示,從羥自由基清除效果來看,大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物抗氧化活性物質(zhì)的吸附能力較弱;對于DPPH·和ABTS+·清除法來說,除S-8大孔樹脂外,其余型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物的抗氧化活性成分均具有較好的吸附能力.為了全面評價(jià)各型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提物抗氧化活性物質(zhì)的吸附與解吸能力,對表2中解吸后的自由基清除率(S1、S2、S3)進(jìn)行正向歸一化處理(式(4)),對未被吸附(即上清液)的自由基清除率(S′1、S′2、S′3)進(jìn)行反向歸一化處理(式(5)),隨后按熵權(quán)法[17]求取各指標(biāo)權(quán)重.

    (4)

    (5)

    利用熵權(quán)法對評價(jià)指標(biāo)S1、S2、S3、S′1、S′2、S′3各自所占的權(quán)重進(jìn)行計(jì)算.以表2中的8組數(shù)據(jù)為樣本,首先對Sij進(jìn)行離差標(biāo)準(zhǔn)化得到y(tǒng)ij后,按式(6)計(jì)算信息熵Ej,按式(7)計(jì)算權(quán)重wj.

    (6)

    (7)

    定義加權(quán)后的綜合抗氧化活性為Z,其計(jì)算方法如下:

    (8)

    圖1 各型號大孔樹脂對靈芝菌絲體水提液的吸附與解吸情況

    各型號大孔樹脂的綜合吸附-解吸能力如表3所示.結(jié)果表明,HPD-400和X-5大孔樹脂的綜合評分相近并明顯高于其它大孔樹脂,且HPD-400在DPPH法和ABTS法中明顯優(yōu)于X-5大孔樹脂,因此選擇中等極性HPD-400大孔樹脂進(jìn)行后續(xù)靈芝菌絲體水提液抗氧化活性物質(zhì)的分離.

    表3 各型號大孔樹脂的吸附-解吸能力綜合評分

    2.1.2 上樣質(zhì)量濃度的確定

    不同上樣質(zhì)量濃度下HPD-400大孔樹脂的吸附與解吸情況分別如圖2~3所示.

    圖2 不同質(zhì)量濃度上樣液吸附后溶液的體外抗氧化活性

    圖3 不同質(zhì)量濃度上樣液洗脫后的體外抗氧化活性

    從圖2可以看出,隨著上樣質(zhì)量濃度的增加,吸附后溶液的自由基清除率逐漸升高,由此推測未經(jīng)大孔樹脂吸附的抗氧化活性成分逐漸增多.而圖3則說明了大孔樹脂對于水提液抗氧化活性成分的解吸情況,即當(dāng)上樣質(zhì)量濃度小于10 mg/mL時(shí),解吸液的體外抗氧化活性持續(xù)上升;上樣質(zhì)量濃度在10~20 mg/mL內(nèi),解吸液的體外抗氧化活性趨于平緩,說明在該上樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi),大孔樹脂的吸附性能達(dá)到飽和;上樣質(zhì)量濃度大于20 mg/mL以后,解吸液的活性顯著下降,這是因?yàn)楦哔|(zhì)量濃度的上樣液黏度較大,且包含很多雜質(zhì),使得大孔樹脂的吸附能力受到影響,導(dǎo)致泄漏點(diǎn)提前出現(xiàn).

    綜上所述,考慮到吸附效率以及后續(xù)稀釋的難易,選擇10 mg/mL為最佳上樣質(zhì)量濃度.

    2.2 大孔樹脂動(dòng)態(tài)梯度洗脫實(shí)驗(yàn)

    2.2.1 上樣體積的選擇

    不同上樣體積流出液抗氧化活性折線圖如圖4所示,對于DPPH·和ABTS+·清除法來說,上樣體積低于100 mL時(shí),從樹脂柱下口流出溶液的自由基清除率隨體積逐漸增加,100 mL以后自由基清除率幾乎平穩(wěn)并接近原始提取液的活性.而對于羥自由基清除法來說,上樣體積為40 mL時(shí)吸附便已趨于飽和,這可能是因?yàn)榇罂讟渲旧韺τ谀軌蚯宄u自由基的化合物的吸附性較差,因此較少的上樣體積即可使大孔樹脂對于具有羥自由基清除效果的化合物的吸附達(dá)到飽和.綜合考慮,確定最大上樣體積為100 mL,即2 BV的10 mg/mL的靈芝菌絲體水提液.

    圖4 不同上樣體積流出液的抗氧化活性

    2.2.2 洗脫液體積分?jǐn)?shù)的選擇

    考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液的體外抗氧化活性,繪制直方圖如圖5所示,從圖中可以直觀看出:靈芝菌絲體水提物被HPD-400大孔樹脂吸附的絕大部分抗氧化活性成分都能被30%的乙醇洗脫下來,其在ABTS+·清除法中體現(xiàn)得最為明顯,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,洗脫物的抗氧化活性逐漸下降.對于羥自由基清除法來說,由于本身被吸附的具有羥自由基清除功能的物質(zhì)就比較少,因此30%乙醇洗脫物的羥自由基清除率雖大于其他組分,但總體差別沒有DPPH法和ABTS法顯著.綜上,選擇30%乙醇洗脫部位進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步分離.

    圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫的洗脫液抗氧化活性

    2.3 大孔樹脂吸附前后抗氧化活性對比

    表4為靈芝菌絲體水提液經(jīng)大孔樹脂吸附處理前后,在不同體積分?jǐn)?shù)下對不同自由基清除效果的擬合曲線及EC50值.

    表4 大孔樹脂吸附前后的自由基清除效果比較

    將待測物在不同評價(jià)方法下的EC50制成直方圖進(jìn)行對比,見圖6.如圖6所示,經(jīng)大孔樹脂處理后的水提液清除DPPH·和ABTS+·的能力有了明顯提高,對DPPH·的清除能力提高了1倍,ABTS+·清除能力為原始水提液的4倍.但對于羥自由基清除法來說,經(jīng)大孔樹脂處理后的30%乙醇洗脫液的EC50升高到了原來的2.13倍,進(jìn)一步說明了羥自由基法和DPPH及ABTS法所針對化合物的抗氧化機(jī)理有所不同,且中等極性大孔樹脂分離得到的物質(zhì)羥自由基清除能力較差,但有著很高的清除DPPH·和ABTS+·的能力.與Wang等[18]有關(guān)桑樹槲皮素提取物的研究一致:經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的桑樹槲皮素提取物DPPH自由基清除率高于提取液,但羥自由基的清除率有所下降.

    圖6 不同評價(jià)方法的EC50對比

    3 結(jié)論

    以DPPH、ABTS和羥自由基清除率為評價(jià)指標(biāo),利用大孔樹脂吸附靈芝菌絲體水提液中抗氧化活性成分,研究發(fā)現(xiàn)大孔樹脂對可清除DPPH·和ABTS+·的物質(zhì)吸附效果較好,吸附可清除羥自由基的物質(zhì)效果較差,中極性的HPD-400大孔樹脂對具有目標(biāo)活性的化合物吸附效果最佳.用不同梯度體積分?jǐn)?shù)的乙醇對吸附完全的HPD-400大孔樹脂柱進(jìn)行洗脫,發(fā)現(xiàn)30%乙醇洗脫部位的抗氧化活性明顯高于其他部位,對比30%乙醇洗脫物與靈芝菌絲體水提物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)大孔樹脂分離得到的物質(zhì)能夠有效提高對DPPH·和ABTS+·的清除效果,其中DPPH·清除效果提高1倍,ABTS+·清除效果提高3倍,但清除羥自由基的能力有所降低.

    猜你喜歡
    水提液菌絲體大孔
    大孔ZIF-67及其超薄衍生物的光催化CO2還原研究
    大孔鏜刀的設(shè)計(jì)
    續(xù)斷水提液誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:52
    桂枝等18種中藥材水提液對5-脂肪氧化酶(5-LOX)活性的抑制作用
    人參水提液通過免疫調(diào)節(jié)TAMs影響A549增殖
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:15
    葡萄糖酸鈉發(fā)酵廢棄菌絲體提取殼聚糖的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:25
    殼聚糖絮凝處理蒲地藍(lán)三味水提液效果及機(jī)理
    新型環(huán)保吸聲材料——菌絲體膠合秸稈
    安全(2015年7期)2016-01-19 06:19:39
    冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中主要核苷類成分分析
    擬黃薄孔菌菌絲體的固體培養(yǎng)條件及CAT和SOD活力動(dòng)態(tài)研究
    给我免费播放毛片高清在线观看| 免费观看的影片在线观看| 久久草成人影院| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品91蜜桃| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 十八禁网站免费在线| 一区二区三区免费毛片| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲性久久影院| 国产乱人视频| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产视频一区二区在线看| 国产精品福利在线免费观看| 中国国产av一级| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲18禁久久av| 一级毛片我不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 精品福利观看| 久久精品国产清高在天天线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久精品大字幕| 久久热精品热| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产av麻豆久久久久久久| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产综合懂色| 国产精品国产高清国产av| 久久人人精品亚洲av| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品伦人一区二区| 黄色配什么色好看| 日韩制服骚丝袜av| 男人的好看免费观看在线视频| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一级a爱片免费观看的视频| av在线天堂中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久99热这里只有精品18| 中国国产av一级| 亚洲国产精品成人久久小说 | 色播亚洲综合网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99热这里只有是精品在线观看| 成年av动漫网址| 精品国内亚洲2022精品成人| 内射极品少妇av片p| 欧美区成人在线视频| 91久久精品电影网| 亚洲精品一区av在线观看| 成人国产麻豆网| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩欧美三级三区| 免费高清视频大片| 超碰av人人做人人爽久久| 99riav亚洲国产免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 晚上一个人看的免费电影| 久久久a久久爽久久v久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 波多野结衣巨乳人妻| 小说图片视频综合网站| 日日撸夜夜添| 国产精品一区www在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 悠悠久久av| 国产男人的电影天堂91| 日日啪夜夜撸| 国产精品日韩av在线免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲自偷自拍三级| 午夜激情欧美在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日韩精品有码人妻一区| 午夜福利视频1000在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 熟女电影av网| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产男人的电影天堂91| 在线免费十八禁| 亚洲丝袜综合中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 国产69精品久久久久777片| 中文字幕av在线有码专区| 久久精品人妻少妇| 一级毛片久久久久久久久女| 校园春色视频在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 18禁在线播放成人免费| 精品久久久久久成人av| 国产高清视频在线播放一区| 日韩欧美免费精品| 内地一区二区视频在线| 免费在线观看影片大全网站| 舔av片在线| 干丝袜人妻中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久久久久久久黄片| 一级黄片播放器| 色5月婷婷丁香| 搡老岳熟女国产| 日韩av在线大香蕉| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品永久免费网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 十八禁网站免费在线| 51国产日韩欧美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 神马国产精品三级电影在线观看| 六月丁香七月| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品一区av在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品国产高清国产av| 丰满的人妻完整版| 美女 人体艺术 gogo| 91狼人影院| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 超碰av人人做人人爽久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| av.在线天堂| 国产成人福利小说| 午夜福利成人在线免费观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久精品94久久精品| 直男gayav资源| 插逼视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 女人被狂操c到高潮| 三级经典国产精品| 欧美性猛交黑人性爽| 99久国产av精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| eeuss影院久久| 欧美性猛交黑人性爽| 国产69精品久久久久777片| 国产色婷婷99| 日韩欧美 国产精品| 听说在线观看完整版免费高清| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成人av一区二区三区在线看| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品久久电影中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美性猛交黑人性爽| 成熟少妇高潮喷水视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 校园春色视频在线观看| 我的老师免费观看完整版| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲第一电影网av| 久久久午夜欧美精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲在线自拍视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 男女那种视频在线观看| 成人三级黄色视频| 99riav亚洲国产免费| 18+在线观看网站| 欧美bdsm另类| 国产中年淑女户外野战色| 白带黄色成豆腐渣| 淫秽高清视频在线观看| 日本在线视频免费播放| av在线观看视频网站免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美极品一区二区三区四区| 午夜福利高清视频| 精品久久久久久久末码| 久久久欧美国产精品| 美女免费视频网站| 久99久视频精品免费| 亚洲国产精品合色在线| or卡值多少钱| 亚洲久久久久久中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 观看免费一级毛片| 精品一区二区三区人妻视频| 免费人成视频x8x8入口观看| a级一级毛片免费在线观看| 日韩中字成人| 一级黄片播放器| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日韩乱码在线| 亚洲av成人精品一区久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲高清免费不卡视频| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜老司机福利剧场| 国产亚洲精品av在线| 久久中文看片网| 久久人人爽人人片av| 国产老妇女一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产成人a区在线观看| 久久热精品热| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品影院6| 成年av动漫网址| 欧美+亚洲+日韩+国产| 夜夜爽天天搞| 成人永久免费在线观看视频| 少妇的逼好多水| 精品日产1卡2卡| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品久久视频播放| 国产色婷婷99| 五月伊人婷婷丁香| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产高清不卡午夜福利| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美人与善性xxx| 国产精品久久久久久精品电影| 韩国av在线不卡| 亚洲电影在线观看av| 国产精品女同一区二区软件| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一夜夜www| 中文字幕久久专区| 亚洲综合色惰| 午夜福利成人在线免费观看| 国产一区二区三区av在线 | 国产在线精品亚洲第一网站| 精品国产三级普通话版| 可以在线观看的亚洲视频| 日韩精品中文字幕看吧| 一级毛片电影观看 | 插阴视频在线观看视频| 国产午夜精品论理片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲av不卡在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 午夜精品在线福利| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲欧美精品综合久久99| 1000部很黄的大片| 亚洲精品国产av成人精品 | 久久午夜亚洲精品久久| 国产高清不卡午夜福利| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av在线观看视频网站免费| 春色校园在线视频观看| 成年版毛片免费区| 亚洲av第一区精品v没综合| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美3d第一页| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 最新中文字幕久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 永久网站在线| 春色校园在线视频观看| 99视频精品全部免费 在线| 日本a在线网址| 人人妻人人看人人澡| 色吧在线观看| 色av中文字幕| 搡老岳熟女国产| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久大精品| 午夜福利成人在线免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 真人做人爱边吃奶动态| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一级毛片我不卡| 99久久九九国产精品国产免费| 免费看美女性在线毛片视频| 91狼人影院| 成人特级av手机在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 日本 av在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 波多野结衣高清无吗| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产欧美日韩一区二区精品| av在线蜜桃| 一个人观看的视频www高清免费观看| 中文资源天堂在线| 黄色视频,在线免费观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 丰满的人妻完整版| 天堂影院成人在线观看| 丰满的人妻完整版| 国产综合懂色| 黑人高潮一二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| eeuss影院久久| 久久久国产成人精品二区| 国产高潮美女av| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品一区二区性色av| 成人无遮挡网站| 少妇高潮的动态图| 丝袜美腿在线中文| 国产黄片美女视频| 六月丁香七月| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品久久久久久久电影| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品亚洲美女久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 99久久精品一区二区三区| 五月玫瑰六月丁香| 午夜精品一区二区三区免费看| 色吧在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产男人的电影天堂91| 成人欧美大片| 露出奶头的视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟妇熟女久久| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲av成人av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 激情 狠狠 欧美| 看片在线看免费视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 日韩一区二区视频免费看| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 色哟哟·www| 中文字幕久久专区| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美成人精品一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久久久久久久成人| 久久6这里有精品| 国产毛片a区久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看 | 久久国内精品自在自线图片| 日本-黄色视频高清免费观看| 俺也久久电影网| 国产熟女欧美一区二区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩欧美 国产精品| 久99久视频精品免费| 日韩av不卡免费在线播放| 51国产日韩欧美| 中文字幕久久专区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品电影一区二区三区| 中文字幕熟女人妻在线| 国产探花极品一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色日韩在线| 国产成人影院久久av| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲内射少妇av| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲专区国产一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 午夜精品一区二区三区免费看| 日日撸夜夜添| 直男gayav资源| 3wmmmm亚洲av在线观看| 在线看三级毛片| 中文字幕av成人在线电影| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品国产高清国产av| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品国产三级普通话版| 一级av片app| 日日啪夜夜撸| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本-黄色视频高清免费观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久久久久久成人| 波多野结衣高清作品| 午夜福利成人在线免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 嫩草影院新地址| 国产精品野战在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品久久久久久精品电影| 日韩制服骚丝袜av| 国产av一区在线观看免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | av在线观看视频网站免费| 欧美色视频一区免费| 内射极品少妇av片p| 色综合站精品国产| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 少妇被粗大猛烈的视频| 69人妻影院| 久久久欧美国产精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 观看免费一级毛片| 免费看a级黄色片| 99久国产av精品国产电影| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本熟妇午夜| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 麻豆一二三区av精品| 亚洲18禁久久av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 少妇被粗大猛烈的视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av视频在线观看入口| 中国美白少妇内射xxxbb| 一级毛片电影观看 | 中文亚洲av片在线观看爽| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久国产成人免费| 欧美潮喷喷水| 久久精品影院6| 久久久久精品国产欧美久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中出人妻视频一区二区| 搡老岳熟女国产| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产真实伦视频高清在线观看| 一进一出抽搐动态| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品成人久久小说 | 黄色日韩在线| 六月丁香七月| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国模一区二区三区四区视频| 女同久久另类99精品国产91| 插阴视频在线观看视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 全区人妻精品视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲18禁久久av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色av中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 成人二区视频| 久久国产乱子免费精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产真实伦视频高清在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产乱人视频| 人妻少妇偷人精品九色| 国产高潮美女av| 成人性生交大片免费视频hd| 午夜福利高清视频| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久九九精品二区国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品人妻熟女av久视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 22中文网久久字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产三级在线视频| 极品教师在线视频| avwww免费| 一本精品99久久精品77| 国产精品一及| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久99热这里只有精品18| 九九爱精品视频在线观看| 香蕉av资源在线| 日韩欧美国产在线观看| 99热只有精品国产| av在线老鸭窝| 精品乱码久久久久久99久播| 国内精品久久久久精免费| 久久久久久大精品| 日韩成人伦理影院| 国产av不卡久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美潮喷喷水| 黄色视频,在线免费观看| 成人永久免费在线观看视频| av在线播放精品| 一个人看的www免费观看视频| 在线观看午夜福利视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | av免费在线看不卡| 九九爱精品视频在线观看| 午夜影院日韩av| 久久精品国产亚洲网站| 色哟哟哟哟哟哟| 国产亚洲精品久久久com| 国产一级毛片七仙女欲春2| 成人性生交大片免费视频hd| 22中文网久久字幕| 国产淫片久久久久久久久| 国产极品精品免费视频能看的| 国产成人aa在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲三级黄色毛片| 少妇的逼好多水| av黄色大香蕉| 久久中文看片网| 国产成人a区在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜影院日韩av| 久99久视频精品免费| 久久欧美精品欧美久久欧美| 美女 人体艺术 gogo| 日韩欧美精品v在线| 国产精品久久电影中文字幕| 香蕉av资源在线| 中文字幕久久专区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一个人看视频在线观看www免费| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 1024手机看黄色片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久a久久爽久久v久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 久久99热6这里只有精品| 少妇丰满av| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩强制内射视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人美女网站在线观看视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久国产网址| 99久国产av精品国产电影| 国产三级在线视频| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品影院6| 天天一区二区日本电影三级| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久久久久九九精品二区国产| 一级av片app| 精品国产三级普通话版| 成人综合一区亚洲| 九九热线精品视视频播放| 特级一级黄色大片| 久久久久九九精品影院| 日韩欧美 国产精品| 99久国产av精品| 深夜精品福利| 国产午夜精品论理片| 日韩欧美精品免费久久| 日韩精品青青久久久久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | a级一级毛片免费在线观看| 一级毛片电影观看 | 精品久久久久久久末码| 成人av一区二区三区在线看| 干丝袜人妻中文字幕| 香蕉av资源在线| 18+在线观看网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品一区二区性色av| 成人鲁丝片一二三区免费| 色吧在线观看| 少妇的逼水好多| 亚洲欧美日韩卡通动漫|