殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜對黃瓜冷害的影響及其機(jī)制研究

王鋒，趙旗峰，張曉萍，楊青珍*

1(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城，044000)2(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 果樹研究所，山西 太谷，030800)

黃瓜含水量高，代謝旺盛，且外皮極薄，在貯藏過程中極易失水萎蔫。低溫在一定程度上可降低黃瓜的生理代謝，但黃瓜是冷敏性果實，低于7～10 ℃極易發(fā)生冷害[1]。我國北方冬天室外溫度長期低于7 ℃，黃瓜采收后，貯運(yùn)過程中長時間處于較低溫度，容易誘發(fā)冷害[2]。冷害導(dǎo)致黃瓜抗病性和耐貯性下降，造成腐爛與品質(zhì)劣變，嚴(yán)重制約黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，尋求抑制冷害技術(shù)是黃瓜貯運(yùn)物流的關(guān)鍵。

可食性涂膜保鮮技術(shù)是將可食性高分子涂布于果蔬表面，形成一層選擇性透過薄膜，一方面可調(diào)節(jié)果蔬與外界氣體交換，抑制呼吸和蒸騰作用，減少水分散失，延緩果實衰老；另一方面可保護(hù)果皮，減少機(jī)械損傷、阻止外界病原菌的侵染，防止果實腐爛[3]。殼聚糖又稱聚氨基葡萄糖、脫乙酰甲殼素，是一種天然堿性陽離子多糖，因其具有無毒、抗菌性、抗氧化活性、生物相容性和生物降解性等優(yōu)點，而廣泛應(yīng)用于砂糖橘[4]、長山藥[5]、杏[6]等果蔬抑制冷害涂膜保鮮中。但單一殼聚糖涂膜在保濕性、機(jī)械強(qiáng)度、韌性等方面存在不足。添加納米ZnO可改善殼聚糖薄膜阻隔性、力學(xué)性能及抗菌性能，目前在甜櫻桃[7]、番石榴[8]涂膜保鮮方面均取得良好效果。褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類重要的色氨酸吲哚類化合物[9]。近年來，外源性褪黑素作為一種通用生物胺類激素和信號生物分子，在桃[10]、青椒[11]、番茄[12]果蔬保鮮中發(fā)揮抗冷害、抑制腐爛、保持感官和營養(yǎng)品質(zhì)等作用。目前僅見殼聚糖[13]、褪黑素[14]對黃瓜單獨(dú)抗冷害研究，而有關(guān)殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜尚未見報道。因此，本試驗研究殼聚糖-納米ZnO、褪黑素及殼聚糖-納米ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜處理對黃瓜冷害、品質(zhì)和抗氧化酶活性的影響，探討其抗冷機(jī)理，以期為黃瓜貯運(yùn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“津研四號”黃瓜采自山西省運(yùn)城市鹽湖區(qū)蔬菜示范基地，采摘結(jié)束后1 h運(yùn)回運(yùn)城學(xué)院果蔬貯藏保鮮實驗室。

褪黑素、NaH2PO4、Na2HPO4、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、MgCl2、乙二胺四乙酸二鈉、H2O2、氧化性谷胱甘肽、三氯乙酸、NaOH、氮藍(lán)四唑等，上海源葉科技有限公司；食品級殼聚糖(脫乙酰度≥95%)，濟(jì)南海德貝生物技術(shù)有限公司；食品級納米ZnO(粒徑50 nm)，青島納卡森鋅業(yè)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TAI604型電子天平、UV-1800型紫外-可見分光光度計、TEL-7001型紅外線CO2分析儀，上海精密儀器有限公司；GY-4數(shù)顯式水果硬度計，浙江樂清艾德堡；DDS-307A電導(dǎo)率儀，上海雷磁；Sigma 315高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司。

1.3 實驗方法

選用瓜條飽滿、順直、粗細(xì)均勻(長為15～30 cm，直徑為2.5～3.0 cm)、無機(jī)械傷和病蟲害的留有1 cm果柄黃瓜為材料。將所選黃瓜隨機(jī)分成4組(每組3個重復(fù)，每個重復(fù)150個果)，分別浸泡在蒸餾水(對照)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%殼聚糖-0.05% ZnO(前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上篩選)、100 μmol/L褪黑素(前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上篩選)及復(fù)合涂膜溶液(0.5%殼聚糖-0.05% ZnO-100 μmol/L褪黑素)中3 min后取出，于10 ℃下風(fēng)干，將黃瓜裝于0.01 mm PE保鮮袋(含3%透氣孔率，國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程中心)，每袋4個果實，平鋪于塑料筐內(nèi)，貯藏于(4±0.5) ℃，相對濕度90%～95%冷庫中。

貯藏過程中，每隔3 d取5個果實用于呼吸速率、硬度、抗壞血酸含量和細(xì)胞膜透性測定，并取樣保存于-80 ℃的超低溫冰箱中，用于·O2-、H2O2、抗氧化酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的測定。另有10個果實置于20 ℃ 3 d條件下用于冷害指數(shù)測定。貯藏結(jié)束時30個果實用于失重率、腐爛率和冷害率的計算。每個處理重復(fù)3次，整個試驗重復(fù)2次。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 冷害指數(shù)和冷害率

冷害指數(shù)和冷害率均參考文獻(xiàn)[15]方法，根據(jù)果實水漬狀斑點和凹陷斑的面積，將冷害程度分為5級。0級，無冷害；1級(<25%)；2級(26%～50%)；3級(51%～75%)；4級(>75%)。

冷害指數(shù)和冷害率分別按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

1.4.2 失重率和腐爛率測定

失重率參考文獻(xiàn)[16]的方法，腐爛率參考陳镠等[7]的方法，失重率和腐爛率均以%表示，分別按公式(3)(4)計算。

(3)

(4)

1.4.3 呼吸速率測定

呼吸速率測定參照文獻(xiàn)[17]方法測定，以CO2mg/(kg·h)表示。

1.4.4 硬度和抗壞血酸含量測定

硬度測定參考文獻(xiàn)[2]方法，采用GY-4數(shù)顯式硬度計(探頭直徑10 mm，測定深度10 mm)測定，選果實中部去皮測果肉硬度，取平均值，以N表示?？箟难岷繙y定采用文獻(xiàn)[18]的方法，單位以mg/g表示。

1.4.5 MDA含量和細(xì)胞膜相對透性測定

MDA含量和細(xì)胞膜相對透性測定參照文獻(xiàn)[19]方法，MDA含量以μmol/g表示，細(xì)胞膜相對透性以%表示。

1.4.6 ·O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量測定

·O2-產(chǎn)生速率和H2O2含量參照文獻(xiàn)[17]方法測定，·O2-產(chǎn)生速率以[NO2·-] μmol/(g FW·min)表示，H2O2含量以μmol/g FW表示。

1.4.7 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)活性測定參照文獻(xiàn)[20]的方法。

SOD活性以每小時抑制氮藍(lán)四唑光化還原50%為1個酶活力單位，以U/(g·h)表示。APX活性以每克黃瓜肉290 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。CAT活性以每克黃瓜肉240 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。GR活性以每克黃瓜肉340 nm處吸光度值1 min變化0.01為1個酶活力單位，以U/(g·min)表示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，差異顯著性檢驗采用最小顯著極差法，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂膜處理對黃瓜冷害指數(shù)和冷害率的影響

冷害指數(shù)是反映果蔬冷害發(fā)生嚴(yán)重程度的指標(biāo)，而冷害率是反映果蔬冷害發(fā)生數(shù)量的指標(biāo)。黃瓜主要冷害癥狀表現(xiàn)為表皮出現(xiàn)大小不一的凹陷斑，隨后會出現(xiàn)水浸狀斑點并逐漸增多，進(jìn)而致病菌侵染冷害斑而出現(xiàn)腐爛，部分果實發(fā)出異味。由圖1-a可知，黃瓜的冷害指數(shù)呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均延緩了黃瓜冷害指數(shù)的上升，從冷藏第6天開始至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時冷害指數(shù)分別比對照降低8.1%、22.4%、22.9%。由圖1-b可知，貯藏15 d時對照黃瓜的冷害率高達(dá)73.3%，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜分別比對照顯著降低19.9%、27.3%、33.9%(P<0.05)。其中復(fù)合涂膜處理冷害指數(shù)和冷害率最低，抑制黃瓜冷害效果最好。

a-冷害指數(shù)；b-冷害率圖1 不同涂膜處理對黃瓜冷害指數(shù)和冷害率的影響Fig.1 Effect of different coating treatment on chilling injury of cucumber during storage

2.2 涂膜處理對黃瓜失重率和腐爛率的影響

由圖2-a可知，貯藏15 d時對照黃瓜的失重率高達(dá)7.33%，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜分別比對照顯著降低36.8%、25.9%、44.3%(P<0.05)。

果蔬發(fā)生冷害后，其冷害部位容易遭受微生物侵染而導(dǎo)致腐爛。由圖2-b可知，貯藏15 d時對照黃瓜的腐爛率高達(dá)51.3%，貯藏15 d時殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理分別比對照顯著降低30.4%、29.3%、44.5%(P<0.05)。其中復(fù)合涂膜處理失重率和腐爛率最低。

a-失重率；b-腐爛率圖2 不同涂膜處理對黃瓜失重率和腐爛率的影響Fig.2 Effect of different coating treatment on weight loss rate and decay rate of cucumber during storage

2.3 涂膜處理對黃瓜呼吸速率的影響

由圖3可知，黃瓜呼吸速率在貯藏前期有個下降過程，可能是貯藏低溫抑制呼吸代謝酶所致。在貯藏中期黃瓜呼吸速率迅速上升，后期呼吸速率變化則較為平緩。在貯藏中后期，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均抑制了黃瓜呼吸速率上升，從冷藏第6天開始至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖3 不同涂膜處理對黃瓜呼吸速率的影響Fig.3 Effect of different coating treatment on respiration rate of cucumber during storage

2.4 涂膜處理對黃瓜硬度和抗壞血酸含量的影響

硬度和抗壞血酸含量是反映果蔬品質(zhì)重要指標(biāo)之一。由圖4-a可知，黃瓜的硬度呈下降趨勢，前期下降緩慢，中后期下降迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均延緩了黃瓜硬度的下降，從冷藏第6天開始至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時硬度分別比對照提高5.3%、14.9%、22.1%。

a-硬度；b-抗壞血酸含量圖4 不同涂膜處理對黃瓜硬度和抗壞血酸含量的影響Fig.4 Effect of different coating treatment on firmness and ascorbic acid content of cucumber during storage

由圖4-b可知，黃瓜的抗壞血酸含量呈下降趨勢，前期下降緩慢，中后期下降迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均延緩了黃瓜抗壞血酸含量的下降，從冷藏第9天開始至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，貯藏15 d時抗壞血酸含量分別比對照提高3.9%、8%、13.5%。

2.5 涂膜處理對黃瓜抗氧化酶活性的影響

SOD是果蔬體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能夠?qū)ⅰ2-歧化成H2O2，進(jìn)而APX、CAT和GR將H2O2清除出去，維護(hù)活性氧代謝平衡，防止對細(xì)胞膜造成傷害。

由圖5-a可知，黃瓜果實內(nèi)的SOD活性初期呈上升趨勢，隨后呈下降趨勢，殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理促進(jìn)SOD活性上升并抑制其下降，保持較高的活性。第3天至貯藏結(jié)束其酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。

由圖5-b可知，黃瓜果實的APX活性在貯藏過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理促進(jìn)APX活性上升并抑制其下降，第6天至貯藏結(jié)束其活性顯著高于對照(P<0.05)。

由圖5-c可知，黃瓜果實隨著貯藏時間的延長CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理保持較高CAT活性，第3天至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

由圖5-d可知，黃瓜果實在貯藏期間隨時間的延長GR活性呈先上升后下降趨勢。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理保持較高的酶活性，第6天至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

a-SOD活性；b-APX活性；c-CAT活性；d-GR活性圖5 不同涂膜處理對黃瓜抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of different coating treatment on antioxidant enzymes activity of cucumber during storage

2.6 涂膜處理對黃瓜·O2-生成速率和H2O2含量的影響

在正常條件下，果蔬活性氧的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，不會傷害細(xì)胞。但當(dāng)遭受低溫冷害時，這種平衡就會被打破，活性氧濃度超過了傷害“闕值”，從而使細(xì)胞的正常代謝不能順利進(jìn)行。由圖6-a可知，黃瓜果實的·O2-生成速率呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理抑制·O2-的上升，第6天至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

由圖6-b可知，黃瓜果實的H2O2含量呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理抑制H2O2含量上升，第6天至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

a-·O2-生產(chǎn)速率；b-H2O2含量圖6 不同涂膜處理對黃瓜·O2-和H2O2的影響Fig.6 Effect of different coating treatment on ·O2- and H2O2 of cucumber during storage

2.7 涂膜處理對黃瓜MDA含量和相對膜透性的影響

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化主要產(chǎn)物，其水平變化反映果蔬遭受低溫冷害膜脂過氧化程度。由圖7-a可知，黃瓜果實的MDA含量呈上升趨勢，前期上升緩慢，中后期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理抑制MDA含量上升，第6天至貯藏結(jié)束與對照差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

相對膜透性是反映果蔬細(xì)胞膜完整性重要指標(biāo)。由圖7-b可知，在貯藏期間，黃瓜的相對膜透性呈現(xiàn)上升趨勢，前后期上升緩慢，中期上升迅速。殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理抑制了相對膜透性的上升，第6天至貯藏結(jié)束與對照差異顯著(P<0.05)。

a-MDA含量；b-相對細(xì)胞膜透性圖7 不同涂膜處理對黃瓜MDA含量和相對膜透性的影響Fig.7 Effect of different coating treatment on MDA content, and cell membrane relative permeability of cucumber during storage

3 討論

低溫貯運(yùn)是黃瓜采后有效的保鮮方法之一，但不適宜低溫容易誘發(fā)冷害。冷害導(dǎo)致黃瓜品質(zhì)裂變，貯藏中或出庫后腐爛嚴(yán)重，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗結(jié)果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理顯著抑制了黃瓜果實冷害的發(fā)生(圖1)，降低了腐爛率(圖2-b)，并保持較高的硬度和抗壞血酸品質(zhì)指標(biāo)(圖4)，且復(fù)合涂膜處理的效果最為顯著。殼聚糖-ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜可在黃瓜表面形成一層選擇性透過膜，一方面防止機(jī)械損傷，起到保護(hù)作用；另一方面對青霉、灰霉菌等有較強(qiáng)的殺菌作用，減輕果實腐爛；第三方面減輕果實冷害。殼聚糖-ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜處理操作簡單、價格便宜、無毒副作用，因而在黃瓜果實冷鏈貯運(yùn)中具有較好的應(yīng)用前景。

采后果蔬失重主要是由蒸騰失水和呼吸作用對營養(yǎng)物質(zhì)消耗引起。當(dāng)果蔬遭受冷害后呼吸強(qiáng)度會大幅增加，營養(yǎng)物質(zhì)消耗增多，導(dǎo)致果蔬失重率增高。本試驗結(jié)果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理顯著降低了黃瓜失重率(圖2-a)，延緩呼吸速度上升(圖3)。褪黑素處理降低黃瓜失重率與抑制呼吸作用有關(guān)。一方面褪黑素可通過調(diào)節(jié)呼吸通路比例和電子傳遞鏈代謝途徑，降低營養(yǎng)物質(zhì)的呼吸消耗水平；另一方面褪黑素可維持較高的ATP和能荷水平，高水平的ATP和能荷通過對糖酵解酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)和線粒體電子傳遞的反饋調(diào)節(jié)，降低營養(yǎng)物質(zhì)的呼吸消耗水平。相似的抑制果蔬呼吸作用減少營養(yǎng)物質(zhì)消耗的褪黑素處理已在青花菜[9]、菜苔[16]等果蔬中得以證實，但在黃瓜上的深層機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。而殼聚糖-ZnO和復(fù)合涂膜處理降低黃瓜失重率可能與黃瓜表面涂膜形成阻隔膜有關(guān)。一方面阻隔膜可抑制果實水分蒸騰，另一方面可延緩果實內(nèi)外氣體交換，形成低氧高二氧化碳的環(huán)境，進(jìn)而抑制果實呼吸作用，減少營養(yǎng)物質(zhì)消耗。相似的抑制呼吸和蒸騰作用減少果蔬失重的殼聚糖復(fù)合涂膜處理已在沙糖桔[3]、番石榴[8]等果實中證實。

正常情況下果蔬體內(nèi)活性氧產(chǎn)生速率與清除速率基本相等，細(xì)胞內(nèi)活性氧不會對膜產(chǎn)生傷害。當(dāng)果蔬處于低溫逆境，活性氧產(chǎn)生速率大于清除速率，造成活性氧積累，過多的活性氧攻擊細(xì)胞膜，引起膜脂過氧化作用，進(jìn)而毒害細(xì)胞，導(dǎo)致果蔬發(fā)生冷害。大量采后處理如甜菜堿[21]、γ-氨基丁酸[22]、1-MCP[23]等可通過提高抗氧化酶活性減輕果蔬冷害。本試驗結(jié)果表明殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均提高SOD、APX、CAT、GR抗氧化酶活性(圖5)，有利于清除·O2-和H2O2(圖6)，使其保持在較低水平，進(jìn)而延緩膜脂化進(jìn)程，使MDA含量和相對膜透性處于較低水平(圖7)，最終減輕黃瓜冷害。相似的提高抗氧化酶活性減輕果蔬冷害的殼聚糖復(fù)合涂膜處理已在石榴[24]、荔枝[25]等果實中得以證實。

4 結(jié)論

殼聚糖-ZnO、褪黑素和復(fù)合涂膜處理均可抑制黃瓜果實冷害發(fā)生，降低失重率和腐爛率，延緩呼吸速率上升，保持較高的硬度和抗壞血酸含量，并提高SOD、APX、CAT、GR抗氧化酶活性，抑制·O2-生成速率和H2O2含量的上升，延緩MDA積累和相對膜透性上升，最終抑制了黃瓜冷害的發(fā)生。其中殼聚糖-ZnO-褪黑素復(fù)合涂膜處理效果最為顯著，而且無毒副作用、操作簡單、價格低廉，因而在黃瓜抑制冷害方面具有廣闊的應(yīng)用前景。