四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分和茶湯色差變化及其相關(guān)性研究

張廳，劉曉，熊元元，王小萍，黃藩，王云，李春華，唐曉波*，郭承義

1(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，四川 成都，610066)2(四川省雅安義興藏茶有限公司，四川 雅安，625101)

黑茶是我國6大茶類之一，是加工過程中有微生物參與品質(zhì)形成的后發(fā)酵茶，主要產(chǎn)于湖南、云南、四川等地。目前四川保留的傳統(tǒng)黑茶花色主要是康磚和金尖兩類邊銷藏茶，其在原料嫩度上有所區(qū)別。近年來，基于“藏茶漢飲”的市場需求，以及人們對黑茶健康作用的認(rèn)識和消費(fèi)需求，很多企業(yè)大量生產(chǎn)了用于滿足非藏族地區(qū)消費(fèi)的新工藝黑茶，如邛崍黑茶。傳統(tǒng)四川黑茶工藝較繁瑣，最多的要經(jīng)過18道工序，經(jīng)過茶葉工作者的不斷改進(jìn)，結(jié)合市場需求及茶葉加工技術(shù)的發(fā)展，其工藝已大為簡化，現(xiàn)階段一種主流做法是采用綠毛茶干坯渥堆，鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、干燥后制得綠毛茶，存放一段時間，再經(jīng)一次性渥堆發(fā)酵到位，再干燥制成黑毛茶。

黑茶初制加工中，有一道特殊的“渥堆”工序，在微生物及其他化學(xué)反應(yīng)的共同參與下，茶葉中的黃酮類、多酚類、生物堿類等具有刺激性、收斂性的物質(zhì)發(fā)生了深度的氧化、聚合、水解，造就了黑茶獨(dú)特的品質(zhì)特征[1]。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員對傳統(tǒng)四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分、酶類活性變化及感官品質(zhì)進(jìn)行了初步研究[2-6]。

茶葉色澤包括干茶色澤、湯色、葉底色澤3部分，是茶葉品質(zhì)的重要組成部分。同時，茶葉色澤與茶葉品質(zhì)存在著一定的關(guān)系，尤其是茶湯色澤與茶葉內(nèi)含成分之間存在一定的相關(guān)性，黃酮醇及其苷類、兒茶素氧化產(chǎn)物被認(rèn)為是影響綠茶茶湯的主要呈色物質(zhì)[7]，因此茶湯色澤的測評在茶葉品質(zhì)的評價中起著重要作用。用于色澤評定的現(xiàn)代儀器分析主要是色差分析，主要依靠均勻顏色空間表征食品色澤屬性。色差分析在紅茶加工及產(chǎn)品品質(zhì)評價方面有較多應(yīng)用，如分析不同紅茶品質(zhì)[8]、評價紅茶湯色亮度[9]、監(jiān)測紅茶萎凋及發(fā)酵等[10-13]，此外色差分析還應(yīng)用到綠茶、黃茶及烏龍茶的品質(zhì)評價中[14-16]，但應(yīng)用到黑茶渥堆過程中茶湯色差的評價中還鮮見報道。

本文對四川黑茶干坯渥堆95 d過程中主要品質(zhì)成分變化進(jìn)行了分析，探明其變化規(guī)律，同時采用色差分析方法，結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計探討了渥堆過程中茶湯色澤變化及其與主要品質(zhì)成分之間的相互關(guān)系，并建立了茶湯色差值與主要品質(zhì)成分的多元線性回歸方程，以期為四川黑茶渥堆過程中品質(zhì)形成機(jī)理的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

渥堆過程樣品，四川省雅安義興藏茶有限公司，取樣時間2019年6月14日～2019年9月18日。

乙腈、甲酸、甲醇(均為色譜純)、咖啡堿、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素(epicatechin，EC)、兒茶素(catechin, C)及標(biāo)準(zhǔn)品楊梅素-3-半乳糖苷等，美國Sigma公司。其他試劑藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QUINTIX224-1CN電子天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-S電子恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HPLC-20 AD高效液相色譜儀、UV-2550紫外-可見分光光度計，日本島津公司，PFX-i Series spectro Colormeter高精度自動分光色差儀，英國Lovibond公司。超高效液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)由Agilent 1290超高效液相色譜(美國Agilent公司)串聯(lián)Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)組成。所用色譜柱為UPLC HSS T3色譜柱(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)，美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 四川黑茶加工工藝流程

鮮葉攤放→殺青→揉捻→炒干→陳放→渥堆→干燥。

渥堆堆高在1 m左右，當(dāng)堆心溫度升至60 ℃以上時，進(jìn)行翻堆，翻堆頻率約每周1次。

1.3.2 樣品采集

每翻堆1次取1次樣，采用5點(diǎn)取樣法，取距堆表50 cm處的茶樣，設(shè)3個重復(fù)，取樣后立即用冰盒保存樣品并帶回實(shí)驗室，供理化分析。取樣包括渥堆0、7、13、20、27、34、41、48、55、61、69、76、83、95 d，共14個茶樣。

1.3.3 主要生化成分測定

水浸出物、茶多酚、兒茶素總量、游離氨基酸含量測定參照國標(biāo)GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013；兒茶素組分、咖啡堿的測定采用HPLC方法[17]；茶黃素、茶紅素、茶褐素含量測定采用系統(tǒng)分析法[18]；茶多糖總量測定參照蒽酮-硫酸法[19]。黃酮醇糖苷類化合物的測定參照王智聰?shù)萚20]及戴偉東等[21]方法進(jìn)行，采用相對定量。

1.3.4 感官審評方法

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》。

1.3.5 茶湯色差值測定

取3 g茶樣，加沸蒸餾水150 mL沖泡5 min，趁熱用濾紙過濾，濾液冷卻至室溫，用分光色差儀測定，3次重復(fù)。采用L、a、b色差系統(tǒng)進(jìn)行測定，其中L值代表明度；a代表紅綠色度，“+”代表紅色程度，“-”代表綠色程度；b代表黃藍(lán)色度，“+”代表黃色程度，“-”代表藍(lán)色程度[9]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用DPS 9.50軟件進(jìn)行方差及顯著性分析、相關(guān)性分析、逐步回歸與通徑分析。采用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分含量的變化

2.1.1 水浸出物含量變化

水浸出物是一切水可溶性物質(zhì)的總和，對茶葉品質(zhì)起決定性的作用。圖1可以看出，在渥堆早期(0～7 d)，水浸出物含量顯著增加，從40.83%增加到50.86%，增幅達(dá)24.57%，隨后逐漸下降到第34天的47.27%，在渥堆中后期(34～61 d)水浸出物含量為46.7%～48.33%，隨后顯著降低至渥堆結(jié)束時的42.57%。整個渥堆過程水浸出物含量增加了4.26%。

圖1 四川黑茶渥堆過程中水浸出物含量變化Fig.1 Content of water extracts of Sichuan dark tea during post-fermentation 注：柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

在渥堆早期，微生物大量繁殖并通過分泌纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等以及濕熱作用使水不溶性的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解為可溶性化合物，從而使水浸出物含量上升；但隨著渥堆的進(jìn)行，微生物繼續(xù)大量繁殖，將分解的可溶性化合物作為碳源、氮源進(jìn)行消耗，使水浸出物含量降低[4-5]。

2.1.2 游離氨基酸含量變化

氨基酸既是茶葉的呈味物質(zhì)，又是茶葉香氣的重要基質(zhì)，對黑茶品質(zhì)形成起著重要作用。由圖2可知，在整個渥堆過程中，游離氨基酸含量呈下降趨勢，但在某個時間段又保持相對穩(wěn)定，直至渥堆結(jié)束，游離氨基酸含量下降了78.80%。

圖2 四川黑茶渥堆過程中游離氨基酸含量變化Fig.2 Contents of free amino acids of Sichuan dark tea during post-fermentation

在渥堆過程中，大量繁殖的微生物分泌胞外酶，將蛋白質(zhì)水解，但整個過程中游離氨基酸并未得到積累，可能是因為微生物將氨基酸作為其生長所需氮源而利用消耗掉，同時，氨基酸與可溶性糖還可產(chǎn)生美拉德反應(yīng)[3]。

2.1.3 咖啡堿含量變化

咖啡堿是茶葉中主要的嘌呤堿，是構(gòu)成茶湯的重要滋味物質(zhì)。圖3可以看出，咖啡堿含量在渥堆前期(0～13 d)呈顯著增加趨勢，由2.91%增加到3.43%，增加了17.87%。在渥堆的第13～48天，其含量穩(wěn)定在3.41%～3.47%，隨后逐漸增加至渥堆結(jié)束時的3.60%。整個渥堆過程中，咖啡堿含量增加了23.71%。

圖3 四川黑茶渥堆過程中咖啡堿含量變化Fig.3 Contents of caffeine of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.1.4 茶多糖含量變化

茶多糖是茶葉中存在的一類具有多種生物活性的多糖復(fù)合物，大多為與蛋白質(zhì)結(jié)合的酸性糖蛋白[22]。目前已有研究表明茶多糖具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種生物功效[23-25]。圖4可以看出，茶多糖含量在整個渥堆過程中呈波動上升趨勢，直至渥堆結(jié)束，茶多糖含量顯著增加3.51倍。茶多糖被認(rèn)為是黑茶中重要的功能性成分之一，其含量在渥堆過程中大幅增加，是黑茶品質(zhì)形成的重要保證。

圖4 四川黑茶渥堆過程中茶多糖含量變化Fig.4 Contents of tea polysaccharide of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2 四川黑茶渥堆過程中多酚類物質(zhì)及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的變化

2.2.1 茶多酚含量變化

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱。由圖5可以看出，在渥堆前期(0～27 d)，茶多酚含量穩(wěn)定在14.15%～14.53%，隨后逐漸下降至渥堆第41天的12.61%，在渥堆第41～61天，茶多酚含量穩(wěn)定在12.40%～12.82%，隨后又逐漸下降至渥堆結(jié)束時的9.60%?？傮w來說，整個渥堆過程，茶多酚含量呈下降趨勢，降幅達(dá)32.4%。

圖5 四川黑茶渥堆過程中茶多酚含量變化Fig.5 Contents of tea polyphenols of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.2 兒茶素總量及組分含量的變化

結(jié)果表明(表1)，兒茶素總量及其組分在渥堆前55 d迅速下降，隨后至第61天有一個短暫的回升，最后又迅速下降至渥堆結(jié)束時的低值。此時，樣品中EGCG、EC、ECG、C含量已非常低甚至檢測不出。在整個渥堆過程中，兒茶素總量、EGC、EC、EGCG和ECG分別下降96.60%、83.33%、93.90%、98.68%和99.17%。

茶葉中的兒茶素是多酚類物質(zhì)的主體，因此，茶多酚含量的減少主要體現(xiàn)在兒茶素類物質(zhì)含量的降低，這與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[2-4]。而茶多酚含量的降低則主要?dú)w因于渥堆過程中茶多酚在微生物分泌的胞外酶及濕熱作用下發(fā)生酶促和非酶促氧化、聚合及轉(zhuǎn)化等系列反應(yīng)[1]。

表1 四川黑茶渥堆過程中兒茶素總量及組分含量的變化 單位：%

2.2.3 茶色素含量變化

茶黃素、茶紅素、茶褐素是黑茶中多酚類物質(zhì)的主要水溶性氧化產(chǎn)物，也是構(gòu)成茶湯色澤及滋味的重要物質(zhì)。圖6-a、圖6-b可以看出，茶黃素和茶紅素含量在整個渥堆過程中均不同程度下降，至渥堆結(jié)束，分別下降53.55%、37.50%。但茶黃素和茶紅素含量在渥堆過程中的某個時間段保持相對穩(wěn)定，說明其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化需要一定的過程及條件。茶褐素含量在渥堆的早期(至第7天)呈下降趨勢，隨后不斷增加，直至渥堆結(jié)束含量達(dá)5.54%，增幅達(dá)110.65%(圖6-c)。

在黑茶渥堆過程中，部分多酚類物質(zhì)主要在多酚氧化酶的作用下氧化、聚合為茶黃素，茶黃素進(jìn)而與雙黃烷醇偶聯(lián)氧化形成茶紅素，最終促使茶褐素的形成[26]。

a-茶黃素；b-茶紅素；c-茶褐素圖6 四川黑茶渥堆過程中茶色素含量變化Fig.6 Changes of tea pigments contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2.4 黃酮醇苷類物質(zhì)含量的變化

茶葉中含有豐富的黃酮苷類物質(zhì)，以黃酮醇苷為主，主要為槲皮素苷、楊梅素苷及山奈酚苷，其水溶液為綠黃色，被認(rèn)為是綠茶湯色的重要組分[26]。如表2所示，在黑茶渥堆過程中主要檢測出了8種黃酮醇苷，含量較高的有山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷和楊梅素-3-半乳糖苷，除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆結(jié)束后顯著增加，黃酮醇苷總量及其他7個組分含量在渥堆結(jié)束后顯著下降，且大多數(shù)黃酮醇苷在渥堆過程中呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

表2 四川黑茶渥堆過程中黃酮醇苷類物質(zhì)含量的變化 單位：mg/kg

2.3 四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤的變化

表3可知，渥堆不同階段茶湯色差值差異顯著，隨著渥堆的進(jìn)行，L值逐漸降低，茶湯明度降低；a值由負(fù)向正逐漸升高，湯色由“綠”向“紅”過度；b值波動升高，湯色黃色程度加深。感官審評顯示，湯色由黃綠→綠黃→黃→橙黃→橙紅→棕紅→棕褐轉(zhuǎn)變，明亮度也逐漸降低，感官審評與色差值契合較好。

表3 四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤的變化Table 3 Changes of tea soup color of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.4 四川黑茶渥堆過程中茶湯色差值與主要品質(zhì)成分含量相關(guān)性分析

由表4可知，黑茶茶湯L值與氨基酸、茶多酚、茶黃素、茶紅素、兒茶素、楊梅素-3-半乳糖苷、楊梅素-3-新橘皮糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、山奈酚-3-阿拉伯糖苷、山奈酚-7-(6″-沒食子酰)葡萄糖苷、山奈酚-3-(6″-鼠李糖基)槐苷含量及黃酮醇苷總量呈極顯著正相關(guān)，與咖啡堿、茶多糖、茶褐素及槲皮素-3-葡萄糖苷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；而a值、b值與各成分含量的相關(guān)性則表現(xiàn)出與L值相反的結(jié)果。

2.5 主要品質(zhì)成分對茶湯L、a、b值的逐步回歸與通徑分析

為了進(jìn)一步分析四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分及色素含量對茶湯色差值影響，并找出影響茶湯色差值的主要因素，以L、a、b值為應(yīng)變量，氨基酸含量X1(%)、茶多酚含量X2(%)、咖啡堿含量X3(%)、茶多糖含量X4(%)、茶黃素含量X5(%)、茶紅素含量X6(%)、茶褐素含量X7(%)、兒茶素總量X8(%)、黃酮醇苷總量X9(mg/kg)為自變量進(jìn)行逐步回歸與通徑分析，并建立了L、a、b值的多元線性回歸方程。結(jié)果見表5～表7。

表4 L、a、b值與主要品質(zhì)成分含量相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of L, a, b value and content of main quality components

由表5可知，當(dāng)考慮各內(nèi)含成分之間的相互作用與交互關(guān)系時，茶黃素含量、茶紅素含量、黃酮醇苷總量的增加可直接促進(jìn)L值的增加；而氨基酸、茶褐素含量對L值的直接抑制作用較大，這些成分是直接影響L值的主要因素。此外氨基酸、茶黃素含量及黃酮醇苷總量通過影響茶紅素及茶褐素含量進(jìn)而對L值產(chǎn)生的間接影響作用也較顯著。

表5 主要品質(zhì)成分對茶湯L值的逐步回歸與通徑分析Table 5 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the L value of tea soup

由表6可知，黃酮醇苷總量對a值的直接通徑系數(shù)達(dá)到了-0.60，是抑制a值的最主要因素，此外，茶黃素含量對a值的直接抑制作用也較為顯著，而茶褐素含量對L值的直接促進(jìn)作用最為顯著。因此，黃酮醇苷總量、茶黃素含量、茶褐素含量是直接影響a值的主要因素。此外，氨基酸、咖啡堿、茶黃素、茶褐素含量及兒茶素總量通過影響黃酮醇苷總量進(jìn)而對a值產(chǎn)生的間接影響也不可忽視。

表6 主要品質(zhì)成分對茶湯a值的逐步回歸與通徑分析Table 6 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the a value of tea soup

表7顯示，茶多糖含量、兒茶素及黃酮醇苷總量對b值的直接抑制作用較大，而茶褐素含量對b值的直接促進(jìn)作用最為顯著，這些成分是直接影響b值的主要因素。此外，一些物質(zhì)通過影響茶多糖含量、兒茶素總量及黃酮醇苷總量進(jìn)而對b值產(chǎn)生間接影響作用也不可忽視。

表7 主要品質(zhì)成分對茶湯b值的逐步回歸與通徑分析Table 7 The stepwise regression and path analysis of the main quality components to the b value of tea soup

3 討論與結(jié)論

渥堆是四川黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序，在此進(jìn)程中，茶葉中內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)變化，形成四川黑茶滋味陳醇、湯色紅濃明亮的品質(zhì)特征。渥堆有濕坯渥堆和干坯渥堆2種方式。渥堆方式、渥堆條件、毛茶原料嫩度及水分含量、渥堆過程中加水量以及人們對渥堆在制品品質(zhì)的把控差異等決定了渥堆時間的長短，渥堆時間從十幾小時至幾十天不等。渥堆時間長短不同，樣品的各種內(nèi)含成分就會有所差異。例如，劉婷婷等[3]研究了傳統(tǒng)四川黑茶在渥堆24 d過程中主要品質(zhì)成分的變化，發(fā)現(xiàn)除咖啡堿含量變化不明顯外，茶多酚、兒茶素、茶黃素、茶紅素、茶褐素、游離氨基酸等均下降。鄒瑤等[6]研究表明：一翻后，四川黑茶品質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化已基本完成。而陳應(yīng)娟等[4]發(fā)現(xiàn)游離氨基酸、茶多酚、兒茶素等的含量在加工過程中均減少，水浸出物、咖啡堿、茶黃素等的含量則增加。LI等[27]研究了下關(guān)沱茶渥堆56 d內(nèi)相關(guān)內(nèi)含成分的變化情況，發(fā)現(xiàn)茶多酚總量下降了54%，而咖啡堿含量上升了59%。茶氨酸和游離氨基酸含量分別降低了81.1%和92.85%。而LI等[28]發(fā)現(xiàn)水浸出物含量、茶多酚總量、總黃酮含量、游離氨基酸含量及可溶性糖含量在湖南黑毛茶渥堆12 h內(nèi)均顯著降低。本課題研究了四川黑茶干坯渥堆95 d內(nèi)主要生化成分的變化情況，一些成分變化表現(xiàn)出了差異性。例如，水浸出含量在渥堆的前7 d顯著增加，而后逐漸下降；咖啡堿含量在渥堆前13 d顯著增加，第13～48天保持相對穩(wěn)定，隨后又逐漸增加至渥堆結(jié)束；兒茶素總量及其組分含量在渥堆前55 d迅速下降，隨后至第61天有一個短暫的回升，最后又迅速下降至渥堆結(jié)束時的低值等。此外，還研究了四川黑茶渥堆過程中黃酮醇苷類物質(zhì)含量的變化，發(fā)現(xiàn)除槲皮素-3-葡萄糖苷含量在渥堆結(jié)束后顯著增加，黃酮醇苷總量及其他7個組分含量在渥堆結(jié)束后顯著下降,且大多數(shù)黃酮醇苷在渥堆過程中呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，黃酮苷類物質(zhì)含量的普遍下降跟渥堆過程中在熱和酶的作用下發(fā)生水解，并進(jìn)一步氧化有關(guān)[26]。

四川黑茶渥堆過程中茶湯色澤變化非常明顯，感官審評表明湯色由黃綠→綠黃→黃→橙黃→橙紅→棕紅→棕褐轉(zhuǎn)變。研究表明，茶湯色澤與茶葉內(nèi)多種內(nèi)含成分存在極顯著的相關(guān)性。以往部分研究及經(jīng)驗表明，不管是干茶還是茶湯色澤應(yīng)由茶葉中呈色相關(guān)物質(zhì)決定。例如楊娟等[8]研究表明茶褐素含量越高，茶湯的亮度越低，但茶湯更紅。王璟等[15]研究表明黃茶的外觀色度值與總?cè)~綠素含量及茶紅素含量有關(guān)。余書平等[13]研究表明紅茶發(fā)酵葉色差值的變化能夠較好地表征兒茶素組分、茶黃素組分、茶紅素、茶褐素的變化特性。朱博等[7]研究表明楊梅素苷類與貯藏期間的綠茶茶湯色澤的關(guān)系最密切。但通過逐步回歸與通徑分析，考慮到各內(nèi)含成分之間的相互關(guān)系與交互作用時發(fā)現(xiàn)，茶紅素、茶褐素含量及黃酮醇苷總量等是直接影響四川黑茶茶湯L值的主要因素，茶黃素、茶褐素含量及黃酮醇苷總量是直接影響四川黑茶茶湯a值的主要因素，而茶多糖、茶褐素含量及兒茶素、黃酮醇苷總量是直接影響四川黑茶茶湯b值的主要因素。另外，一些物質(zhì)還可以通過影響另一些物質(zhì)的含量進(jìn)而對茶湯色差值產(chǎn)生間接影響。本研究還建立了L、a、b值與主要內(nèi)含成分之間的多元線性回歸方程，初步探明了四川黑茶渥堆過程中茶湯色差值與主要內(nèi)含成分之間的關(guān)系。