清香型小曲白酒釀造中酵母資源解析及其耐受性能研究

李群，林斌，唐潔，江威，朱麗萍，楊強(qiáng)，劉源才，陳申習(xí)

(勁牌有限公司 勁牌研究院，中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶，435100)

酵母是白酒釀造中三大主要功能微生物類群之一，其在糖化和發(fā)酵過程中數(shù)量與種類不斷變化，促進(jìn)了底物轉(zhuǎn)化為乙醇并形成多種香味物質(zhì)[1-2]。在我國(guó)，由于地理環(huán)境和釀造工藝的不同使得白酒在發(fā)展中形成了多種香型，如清香型、濃香型和醬香型，從而導(dǎo)致酵母菌群的種類、分布也存在一定的差異[3-5]。相比于醬香和濃香型白酒，對(duì)清香型白酒中酵母種類研究較少，主要集中在釀酒酵母、漢遜酵母、東方伊薩酵母及假絲酵母等[6-8]。因此，從清香型白酒酒曲中篩選新的優(yōu)良酵母是持續(xù)提升白酒出酒率和酒質(zhì)的重要方法[9-11]。

近年來高通量測(cè)序技術(shù)在清香型小曲白酒釀造微生物的研究中獲得重要進(jìn)展，為小曲白酒微生物的研究指明了方向[12-14]。但其無法獲得活的菌株應(yīng)用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，限制了菌株的應(yīng)用。傳統(tǒng)經(jīng)典分離方法補(bǔ)充了高通量測(cè)序技術(shù)的弊端，可為生產(chǎn)應(yīng)用提供大量潛力菌種。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，酵母會(huì)受到脅迫條件的影響，如高溫、高糖、高乙醇環(huán)境等，因此生產(chǎn)中對(duì)菌株的生理特性有一定的要求，獲得菌株并開展對(duì)生存環(huán)境的耐受性是進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)[15]。

清香型白酒釀造體系復(fù)雜，對(duì)微生物的變化演替研究成為熱點(diǎn)。王薇等[16]從清香型白酒酒曲酒醅中鑒定出10種酵母，除了常見的釀酒酵母、東方伊薩酵母、異常畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母外，阿氏絲孢酵母(Trichosporonasahii)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、高滲漢森菌(Hanseniasporaosmophila)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)、粉狀畢赤酵母(Pichiafarinosa)和發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)均為首次從清香型白酒釀造過程中分離獲得的酵母種類。杜艾明等[5]對(duì)黃鶴樓清香型白酒釀造體系中酵母進(jìn)行了研究，主要為釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、東方伊薩酵母、扣囊腹膜孢酵母和扁平云假絲酵母，其中釀酒酵母和異常威克漢姆酵母為優(yōu)勢(shì)菌。耿添霈等[17]從汾酒缸花中篩選出畢赤酵母(Pichia)、威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)、腹膜孢酵母(Saccharomycopsis)、假絲酵母(Candida)與邁耶氏酵母(Meyerozyma)5個(gè)酵母屬，其中馬朗加腹膜孢酵母(Saccharomycopsismalanga)首次在清香型白酒釀造環(huán)境中發(fā)現(xiàn)。我們前期對(duì)勁牌公司小曲白酒酒曲和酒醅中酵母進(jìn)行篩選，獲得幾株釀酒酵母和畢赤酵母，種類較少[18]，可能是環(huán)境中霉菌生長(zhǎng)過快影響了酵母的純化和分離。而近期文獻(xiàn)報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加有機(jī)酸可以很好地抑制霉菌生長(zhǎng)，有利于酵母的生長(zhǎng)[19]。因此，本文以多種常規(guī)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過添加不同比例乳酸和乙酸抑制樣品中霉菌菌絲蔓延，從清香型小曲白酒酒曲和酒醅中分離酵母，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和26S rRNA分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其種屬。同時(shí)，對(duì)所篩選的酵母的生理特性和環(huán)境耐受性進(jìn)行研究，以期為清香型小曲白酒生產(chǎn)儲(chǔ)備優(yōu)良酵母資源。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

E200生物顯微鏡，尼康；2720 Thermal Cycler PCR儀，賽默飛世爾科技；DYY-8C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ZF-288全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，上海嘉鵬科技有限公司；5424 R離心機(jī)，Eppendorf公司；WFJ 2000可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；JJ6000電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；MJ-250BSH-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1B凈化工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-75SII高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 材料與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品和試劑

分離酵母所用酒醅樣品于2019年10～12月取自勁牌公司楓林三分廠釀造三車間，酒曲取自勁牌毛鋪制曲車間。

生化試劑：PDA培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨、瓊脂粉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；青霉素，華北制藥股份有限公司；黃豆芽，超市購(gòu)買；麥芽浸粉，天津市利發(fā)隆化工科技有限公司。

分析純?cè)噭浩咸烟恰⒈徕c、乳酸、乙酸、脫氧膽酸鈉、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、KNO3、Na2HPO4、NaH2PO4、KCl、FeSO4、蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、甘油，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 培養(yǎng)基及試劑配制

PDA培養(yǎng)基：按照PDA合成培養(yǎng)基配方稱取適量樣品，并加入10 g/L的丙酸鈉加熱溶解，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素或3.3 mL/L的乙酸[19](下同)。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，瓊脂20，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。分別加入0.3 g/L脫氧膽酸鈉，或3.3 mL/L的乙酸，或V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶1(乙酸3.0 mL/L)，或V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶2(乙酸2.3 mL/L)，V(乙酸)∶V(乳酸)=1∶3(乙酸2.0 mL/L)。

孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，KH2PO41，無水MgSO40.5，孟加拉紅0.033，瓊脂20。傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。分別加入0.3 g/L脫氧膽酸鈉，或3.3 mL/L的乙酸。

察氏培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30，NaNO33，K2HPO41，MgSO40.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂20。

豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基(g/L)：黃豆芽100，葡萄糖50，瓊脂20。稱取新鮮黃豆芽100 g，置于燒杯中，加入1 000 mL水，加熱至沸騰，維持30 min，用8層紗布趁熱過濾，濾渣棄去。濾液補(bǔ)充水分到1 000 mL，即制成10%豆芽汁，再加入葡萄糖煮沸，之后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化，再分裝，傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：麥芽浸粉30、瓊脂15。傾倒平板前加入0.5 g/L的青霉素和3.3 mL/L的乙酸。

DNA提取重懸液：50 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖溶液、1 mmol/L EDTA-2Na、體積分?jǐn)?shù)5%甘油。

以上培養(yǎng)基和重懸液使用前均于121 ℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母的分離純化方法

取5 g酒醅或酒曲樣品置于裝有95 mL無菌水的三角瓶中，置于150 r/min搖床中，30 min后取出，梯度稀釋，分別取200 μL濃度為10-3和10-4CFU/mL的菌懸液分別涂布于YPD培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，對(duì)平板上所得到的不同酵母菌落進(jìn)行劃線純化，將得到的純化菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3 d后在4 ℃保藏。

1.3.2 酵母的形態(tài)描述

將分離純化的酵母接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，在顯微鏡下觀察酵母細(xì)胞形態(tài)和出芽情況。

1.3.3 酵母DNA的提取與PCR擴(kuò)增[20]

取1.5 mL離心管，加入100 μL雙蒸水，無菌條件下挑取酵母菌體于離心管中攪勻，將混合物充分渦旋，在8 000～10 000×g離心1 min。吸取上清液，加入100 μL重懸液，置于85 ℃下水浴40 min，然后置于-20 ℃下冷凍10 min，即得到DNA，以其為模板，采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)及18S-P1(5′-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3′)和18S-P2(5′-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′)。PCR反應(yīng)體系為PremixTaq15 μL、DNA菌液2 μL、引物①0.5 μL、引物②0.5 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)充至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，接下來35個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后一個(gè)循環(huán)在72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶有無，最后將含有目的條帶的PCR原液送到武漢華大基因進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過BioEdit軟件進(jìn)行剪切，并輸入NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索，獲得近似序列。

1.3.4 菌種生理生化鑒定

對(duì)篩選酵母進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、類淀粉實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[21]。

1.3.5 菌株耐受特性分析[22-23]

將活化后的菌株按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量(107CFU/mL)接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)2 d，用紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定發(fā)酵液OD值。考察對(duì)象為葡萄糖質(zhì)量濃度(0、50、100、150、200、250 g/L)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(3%、6%、9%、12%、15%)、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5)和溫度(15、25、30、45、55 ℃)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Photoshop CS5對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分子生物學(xué)鑒定

從酒曲酒醅中共分離出71株酵母，因7株菌在表觀形態(tài)、微觀形態(tài)相似，故共鑒定了64株，其中1株酵母(J-13)沒有鑒定出。如表1所示，鑒定出的63株酵母分屬于7個(gè)屬13個(gè)不同種，分別為異常威克漢遜酵母(12株)、扣囊腹膜孢酵母(4株)、季也蒙畢赤酵母(1株)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(17株)、發(fā)酵畢赤酵母(10株)、外島畢赤酵母(1株)、膜醭畢赤酵母(1株)、釀酒酵母(10株)、白地霉(2株)(A.loubieri(1株)、T.loubieri(2株)、阿氏絲孢酵母(1株)和S.pararoseus(1株))，其中A.loubieri、T.loubieri和S.pararoseus首次在清香型白酒中發(fā)現(xiàn)。

2.2 分離純化的酵母在平板上的菌落形態(tài)特征

如圖1所示，釀酒酵母呈乳白色圓形，有光澤，邊緣整齊，顯微下為圓球形。季也蒙畢赤酵母呈白色奶油狀，平滑濕潤(rùn)有光澤，顯微下為圓球形；發(fā)酵畢赤酵母呈乳白色無光澤，邊緣不整齊，菌落凸起，有褶皺，單個(gè)酵母細(xì)胞為橢圓形；庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌落形態(tài)為奶油白色圓形，邊緣呈齒蝕狀，菌體凸起有褶皺，顯微下為橢圓形；膜璞畢赤酵母為乳白色，邊緣不整齊，菌落凸起有褶皺，單個(gè)酵母細(xì)胞呈梭形和卵圓形；外島畢赤酵母為乳白色，邊緣不整齊有短小絨毛，菌落凸起有褶皺，單個(gè)酵母細(xì)胞為卵圓形。這幾類酵母在白酒風(fēng)味物質(zhì)形成中具有重要的作用[24]。異常威克漢遜酵母菌落呈奶油白色圓形，邊緣環(huán)紋起皺，菌體黏稠，顯微下為卵圓形和橢圓形；扣囊腹膜孢酵母菌落形態(tài)為白色圓形，質(zhì)地呈短絨毛狀，菌落邊緣呈齒蝕狀，顯微下為卵圓形，有假菌絲和子囊孢子；白地霉呈奶白色圓形，表面絨毛狀，生長(zhǎng)直徑可達(dá)2 cm左右，顯微下能觀察到橫隔和節(jié)孢子，孢子形狀為長(zhǎng)筒形，末端鈍圓。阿氏絲孢酵母、A.loubieri和T.loubieri均為絲孢酵母屬下不同種。阿氏絲孢酵母為白色圓形，無光澤有凸起，呈腦回狀，菌落邊緣呈齒蝕狀，顯微下為圓形，長(zhǎng)桿形、末端鈍圓，有假絲和厚垣孢子；A.loubieri為淡黃色，菌落隆起無光澤，邊緣整齊，單個(gè)細(xì)胞為球形或短矩圓形，有假菌絲。T.loubieri菌落早期為乳白色，菌體濕潤(rùn)，邊緣不整齊，中間凸起，后期菌落漸漸變黃，菌體干燥，可見伸入培養(yǎng)基假菌絲，單個(gè)酵母細(xì)胞為圓球形，有假菌絲，并可見橢圓形和柱狀的關(guān)節(jié)孢子。近玫色鎖擲孢酵母呈橘紅色圓形，光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，顯微形態(tài)為圓形和橢圓形。

2.3 酵母菌株生理生化實(shí)驗(yàn)

如表2所示，糖發(fā)酵結(jié)果表明大多數(shù)酵母均可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，或?qū)ζ咸烟恰⒄崽怯锌勺兎磻?yīng)；能發(fā)酵麥芽糖的酵母占一半，僅扣囊腹膜孢酵母(J-6)發(fā)酵可溶性淀粉，T.loubieri(J-39)發(fā)酵乳糖和海藻糖；阿氏絲孢酵母(J-5)和膜璞畢赤酵母(J-26)均不發(fā)酵這6種糖類。氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A.loubieri、T.loubieri、白地霉、膜璞畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母和發(fā)酵畢赤酵母對(duì)硝酸鈉具有同化作用，其余酵母對(duì)硝酸鹽不具有同化作用。脲酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵畢赤酵母和近玫色鎖擲孢酵母為脲酶產(chǎn)生菌株，其余菌株為不產(chǎn)生脲酶菌株。類淀粉合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這13種酵母菌均不合成類淀粉。

A-酵母菌落；B-顯微形態(tài)；A1-P.exigua菌落； A2-P.membranifaciens菌落圖1 13種不同酵母菌落和顯微形態(tài)Fig.1 Colonies and microscopic morphology of 13 different yeasts

表2 不同酵母生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of different yeasts

2.4 環(huán)境耐受性分析

2.4.1 耐高糖實(shí)驗(yàn)

如圖2所示，釀酒酵母(J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)和T.loubieri(J-39)生物量隨著糖濃度升高而增加，在最高糖質(zhì)量濃度250 g/L下均可生長(zhǎng)，說明此3株酵母葡萄糖耐受性最高；白地霉(J-23)和A.loubieri(J-14)菌株僅在葡萄糖含量低時(shí)生物量最高，說明其葡萄糖耐受性較差。

圖2 葡萄糖含量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of glucose content on yeast growth

2.4.2 耐乙醇實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，所有酵母菌株隨著乙醇含量增加生長(zhǎng)均受到抑制，酵母生物量減少，相對(duì)來說，釀酒酵母(J-52)耐乙醇能力最強(qiáng)，在12%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)下仍有一定的生長(zhǎng)，扣囊腹膜孢酵母(J-6)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(J-8)耐乙醇能力其次，在9%乙醇下仍生長(zhǎng)較好。白地霉(J-23)和膜璞畢赤酵母(J-26)耐乙醇性最差，即使在最低乙醇3%時(shí)生長(zhǎng)仍受到抑制。

圖3 乙醇含量對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of alcohol content on yeast growth

2.4.3 耐pH實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，所有酵母菌株生物量隨著pH增加而減少，釀酒酵母(J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(J-8)生物量較高，耐酸性較強(qiáng)；膜璞畢赤酵母(J-26)生物量最低，耐酸性最差。

2.4.4 耐高溫實(shí)驗(yàn)

如圖5所示，所有酵母生物量隨溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，其中T.loubieri和異常威克漢遜酵母在45 ℃具有最高生物量，說明這2株菌在45 ℃高溫下能較好生長(zhǎng)；與其它酵母菌株相比，庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母和釀酒酵母在55 ℃下仍具有較高生物量，表明它們耐高溫性好。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on yeast growth

3 結(jié)論

本研究通過經(jīng)典分離法從勁牌公司酒曲和酒醅中獲得了71株酵母，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定了63株，分屬于7個(gè)屬13個(gè)種，從種類可以看出，多為釀酒酵母、異常威克漢遜酵母、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母和發(fā)酵畢赤酵母。其中篩選得到的A.loubieri、T.loubieri和S.pararoseus是實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)前期未篩選到的，在清香型白酒中未見報(bào)道，通過資料查詢發(fā)現(xiàn)此3種菌均存在于其他香型白酒酒曲中，對(duì)白酒風(fēng)味形成具有貢獻(xiàn)作用。有研究表明，T.loubieri為條件致病菌，但目前未見其在白酒釀造中致病的報(bào)道，未來有必要加大該菌在釀造中的生長(zhǎng)代謝研究，明確其生物安全性。另外，經(jīng)過生理特性研究，大多數(shù)酵母能發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，A.loubieri、T.loubieri、白地霉、膜璞畢赤酵母、扣囊腹膜孢酵母和發(fā)酵畢赤酵母對(duì)NaNO3具有同化作用，發(fā)酵畢赤酵母和S.pararoseus為脲酶產(chǎn)生菌株，13種酵母均不能合成類淀粉?？鼓嫘匝芯勘砻鳎劸平湍?J-52)、扣囊腹膜孢酵母(J-6)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(J-8)和T.loubieri(J-39)對(duì)高糖、高乙醇、高酸和高溫具有良好的耐受性，具有廣泛的應(yīng)用前景。下一步將在清香型小曲白酒釀造工藝下對(duì)這13種酵母代謝產(chǎn)物及與其他菌株互作關(guān)系開展研究，探討其對(duì)原酒質(zhì)量影響，以期為清香型小曲白酒品質(zhì)提升，提供優(yōu)勢(shì)菌株。