蘇葶平喘湯對難治性哮喘小鼠模型c-jun表達(dá)的影響*

宋桂華，周瓊閣，張 巖，管志偉，呂偉剛 ，郭彥榮，張冰雪，彭明浩

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，規(guī)范治療3～6個月仍不能達(dá)到良好控制的哮喘稱之為難治性哮喘，激素抵抗是難治性哮喘的主要原因之一[1-2]。難治性哮喘占支氣管哮喘的5%～10%，不僅嚴(yán)重影響兒童的身心健康及生活質(zhì)量，還給家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)蛋白產(chǎn)物c-jun的表達(dá)與激素抵抗型哮喘的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系，因其可能參與降低糖皮質(zhì)激素的抗炎活性而致糖皮質(zhì)激素抵抗，從而發(fā)展為難治性哮喘[5-6]。研究[7-9]表明，中醫(yī)藥治療難治性哮喘有獨(dú)特優(yōu)勢，已成為研究熱點(diǎn)。課題組綜合多年來臨床治療兒童難治性哮喘的經(jīng)驗，基于痰瘀互結(jié)之理論，創(chuàng)立蘇葶平喘湯，臨床療效顯著，但缺乏客觀依據(jù)來驗證。故本研究通過建立難治性哮喘小鼠模型研究蘇葶平喘湯對難治性哮喘小鼠肺部病理改變及肺組織c-jun表達(dá)的影響，探討蘇葶平喘湯治療兒童難治性哮喘的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

無特定病原體(specified pathogen free，SPF) 級BALB/C雌性小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號SCXK(魯)20140007]，動物質(zhì)量合格證號為37009200016677。動物實驗于河南省中醫(yī)藥研究院動物中心SPF級動物房[許可證號SYXK(豫)2019-0001]完成。本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(審批編號20180829001)。 動物購買后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

蘇葶平喘湯組成：紫蘇子10 g，葶藶子10 g，蜜紫菀10 g，款冬花10 g，浙貝母10 g，姜半夏10 g，膽南星10g，橘紅6 g，茯苓10 g，地龍6 g，赤芍6 g，川芎6 g，甘草片 6 g。藥材由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。所有藥材經(jīng)浸泡、煎熬、過濾，濃縮成100 mL藥汁，1 mL含0.71 g生藥。將藥汁裝入已消毒容器中，置于4 ℃冰箱保存。地塞米松注射液，2 mL∶5 mg，河南潤弘制藥股份有限公司產(chǎn)品,批號21901131；氯化鈉注射液，500 mL∶4.5 g，河南科倫藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號A18121804-1。卵清蛋白(OVA)Grand Ⅴ、Grand Ⅱ，Sigma公司產(chǎn)品，批號依次為SLBK6455V，SLBP0782V；氫氧化鋁 [AL(OH)3]粉，500 g/瓶，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號20180902；水合氯醛，鄭州派尼化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號180408；40 g/L多聚甲醛通用型組織定液,武漢賽維爾生物有限公司產(chǎn)品，批號YP184309；c-jun試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司產(chǎn)品，批號PSHNDEFJE3；總核糖核酸(RNA)提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號R1200；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司產(chǎn)品，批號0000280839；熒光定量試劑，Roche公司產(chǎn)品，批號06402712001；引物，上海生物工程有限公司產(chǎn)品。NE-C900型霧化吸入器，歐姆龍有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，德國徠卡公司產(chǎn)品；DFC420型彩色冷CCD及圖像分析系統(tǒng)，德國徠卡公司產(chǎn)品；ST360型酶標(biāo)儀，上?？迫A生物工程股份有限公司；MY-10型手持式組織研磨器，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品； NanoDroP2000型微量核酸測量儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；LCZ480型熒光定量PCR儀，美國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；無酶離心管，愛思進(jìn)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組及模型的建立

將50只小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、蘇葶平喘湯組、地塞米松組，蘇葶平喘湯和地塞米松組，每組10只。按照參考文獻(xiàn)[10-11]復(fù)制難治性哮喘小鼠模型，分為致敏和激發(fā)兩個過程：致敏期2周，激發(fā)期從第3周開始，維持共11周。造模完成，經(jīng)組織病理學(xué)鑒定模型制備成功。

1.4 治療方法

自激發(fā)第7周起，各組進(jìn)行如下處理。蘇葶平喘湯組：灌胃蘇葶平喘湯水煎劑16.68 g/(kg·d)(按正常人體劑量9.1倍進(jìn)行折算)，并腹腔注射0.5 mL生理鹽水。地塞米松組：灌胃生理鹽水0.5 mL；并給予地塞米松1 μg/(g·d)，腹腔注射 0.5 mL。蘇葶平喘湯和地塞米松組：灌胃蘇葶平喘湯水煎劑16.68 g/kg；并給予地塞米松針1 μg/(g·d)，腹腔注射0.5 mL。空白對照組和模型對照組給予等量生理鹽水進(jìn)行灌胃和腹腔注射。各組均1 d 1次，連續(xù)3周。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

末次給藥24 h內(nèi)給予各組小鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L的水合氯醛(10 μL/g體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉，快速眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘取肺組織。取全血置于普通試管內(nèi)，靜置2 h后，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。取小鼠左肺組織，以40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)制備病理切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。取右肺放入無酶的微型離心管中，置于-80 ℃冰箱內(nèi)，以備逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測。200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變，以實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測c-jun表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

在實驗過程中，小鼠共死亡3只。蘇葶平喘湯組死亡1只，發(fā)生在造模過程中，考慮為難治性哮喘急性發(fā)作所致。蘇葶平喘湯和地塞米松組死亡2只，其中1只在灌胃后死亡，考慮灌胃過程中操作失當(dāng)而致；另外1只小鼠考慮長期腹腔注射導(dǎo)致腹腔感染而致。

2.1 肺組織病理學(xué)改變

空白對照組小鼠肺組織未見炎性改變。模型對照組支氣管管壁厚度增加，支氣管管壁及周圍均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，管腔狹窄，形狀不規(guī)則，管腔內(nèi)可見大量黏液分泌。3個藥物組較模型對照組支氣管病變減輕，以地塞米松組+蘇葶平喘湯組最優(yōu)。見圖1。

2.2 實時熒光定量RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

2.2.1 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的擴(kuò)增曲線

見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的擴(kuò)增曲線圖

2.2.2 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的溶解曲線

見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的溶解曲線圖

2.2.3 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

與空白對照組對比，模型對照組c-Jun mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，3個藥物組的c-Jun mRNA表達(dá)減少(P<0.05)。3個藥物組的c-Jun mRNA組間對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠肺組織中c-Jun mRNA的表達(dá)

3 討 論

美國科學(xué)家Lee等[12]首次發(fā)現(xiàn)了核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(Nuclear transcription factor activator protein-1，AP1)，并鑒定其為轉(zhuǎn)錄因子。AP1是Jun、Fos、ATF和MAF形成的同源或異源二聚體[13]，其中最為穩(wěn)定的AP1二聚體形式是由c-Fos和c-Jun組成的[14]。在正常情況下，AP1的蛋白水平和活性很低。當(dāng)受到外來刺激(如生長因子、趨化因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)介質(zhì)激素及環(huán)境壓力等)時，AP1被激活，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個調(diào)節(jié)過程[15]，對免疫炎癥性疾病[16-17]的發(fā)生發(fā)展起重要作用。具體來說，AP1可通過調(diào)控先天性免疫系統(tǒng)的活性，與其他家族的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，調(diào)控原始T細(xì)胞分化，與糖皮質(zhì)激素受體相互作用或通過反式抑制等方式來參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[18]。哮喘作為一種氣道慢性炎癥性疾病，可使AP1的活性增強(qiáng)，而糖皮質(zhì)激素作為機(jī)體重要的應(yīng)激激素和臨床常用的抗炎、抗免疫藥物，可下調(diào)AP1的表達(dá)。難治性哮喘以病情反復(fù)、難以控制為主要特點(diǎn)，是一種吸入中高劑量糖皮質(zhì)激素等藥物足劑量足療程仍不能達(dá)到良好控制的哮喘，其糖皮質(zhì)激素抵抗作用受糖皮質(zhì)激素受體、轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、P糖蛋白及巨噬細(xì)胞游走抑制因子的影響[19]。其中AP1對難治性哮喘患者糖皮質(zhì)激素抵抗作用的影響主要體現(xiàn)在：①AP1的過度活化可影響JNK/AP-1信號通路，阻斷糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)單元及其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，發(fā)揮抑制作用[20];②抑制了糖皮質(zhì)激素抗膠原生成的作用，使成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原增多，加重了氣道重構(gòu)，使支氣管壁硬化，減弱了糖皮質(zhì)激素的治療作用[21]。

蘇葶平喘湯為自擬方，由蘇葶丸合滌痰湯化裁而來，輔以活血化瘀之赤芍、川芎、地龍。《醫(yī)宗金鑒》曰：“痰飲壅逆因作喘，痰飲蘇草滾痰從，停飲喘急不得臥，瀉飲降逆蘇葶功?！碧K葶丸由紫蘇子、葶藶子組成，治療急性支氣管炎和哮喘療效確切[22-25]。滌痰湯是中醫(yī)治療痰證的一首古方，在《奇效良方》及《證治準(zhǔn)繩》中均有記載[26]，由膽南星、半夏、枳實、茯苓、橘紅、石菖蒲、人參、竹茹、甘草組成。該方本為中風(fēng)后痰迷心竅而用，古方今用，被用于支氣管炎哮喘的治療，對抑制氣道重塑、緩解氣道炎癥反應(yīng)有積極作用[27]。

方中紫蘇子主治咳逆痰喘，潤心肺，尤能下氣定喘，止嗽消痰，利膈寬胸，溫中開郁。葶藶子滑潤而香，瀉肺定喘。肺為水源，葶藶子不僅能瀉肺氣還能瀉肺水。紫蘇子與葶藶子共為君藥。紫菀、款冬花降氣平喘，疏利開通，以利肺氣；浙貝母清熱化痰，開宣肺氣。半夏辛溫性燥，能燥濕化痰，和胃降逆；膽南星、橘紅可加強(qiáng)半夏燥濕化痰的作用，且橘紅有理氣行滯之功，與半夏合用體現(xiàn)了治痰先理氣、氣順則痰消的治療理念。肺脾不足，風(fēng)邪乘之，而痰壅其經(jīng)絡(luò)。茯苓益氣補(bǔ)脾，以杜絕生痰之源。以上各藥共為臣藥。地龍性走竄，搜風(fēng)剔絡(luò)以止咳平喘?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，地龍可抑制肺組織平滑肌肌動蛋白及纖維連接蛋白，松弛氣管平滑肌，改善氣道纖維化，防止氣道重塑，其有效成分琥珀酸和次黃嘌呤具有平喘止咳的功效[28-29]。赤芍、川芎活血化瘀，可消除肺微血管痙攣，改善局部微循環(huán)，減輕肺纖維化[30-31]。地龍、赤芍、川芎為佐藥。甘草既可助茯苓益氣健脾，又可調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏祛痰通絡(luò)、活血化瘀之功，組方精煉，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，升中有降，開中有合，寒溫得宜，使宣降得復(fù)、痰飲得消、瘀血得散，喘證自平。

本研究結(jié)果證實了蘇葶平喘湯能有效抑制激素抵抗型哮喘小鼠體內(nèi)AP1產(chǎn)物c-Jun的表達(dá)，并能改善肺部炎癥的浸潤，揭示了該方治療激素抵抗型哮喘的主要作用機(jī)制，為中醫(yī)藥更好治療哮喘提供了科學(xué)依據(jù)。