鄰苯二酚/微纖維膠原止血水凝膠的制備及其性能研究

祁增華，李 釩，丁 晟，楊 焜，田 豐

（軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所，天津 300161）

0 引言

外傷出血是戰(zhàn)現(xiàn)場最常見的傷情，不可控失血是導(dǎo)致傷員現(xiàn)場死亡的首要原因。即使失血傷員后送至醫(yī)院搶救，院前大量失血仍會造成較高的死亡率和嚴重的并發(fā)癥（如截肢等）[1]。因此，研究一種能夠快速、高效、救治火線傷員的止血器材意義重大。

由于環(huán)境的特殊性，海戰(zhàn)傷員的傷口極易接觸海水，而海水具有低溫、高滲、高鈉、高氯、偏堿性以及含菌量高等極特殊的理化特性[2]。一旦傷員受傷后傷口不及時處理經(jīng)海水浸泡，就會使傷員的傷情變得更加復(fù)雜，并且長時間浸泡海水會給傷員全身都帶來非常嚴重的傷害。目前我軍應(yīng)用的創(chuàng)傷急救敷料、急救止血繃帶、自黏彈性繃帶等包扎止血器材均無法滿足高濕環(huán)境下的部隊保障需求，因此亟須研制一種可在高濕環(huán)境下使用的具備高效止血功能的材料，進而為研制高濕環(huán)境下使用的包扎止血系列裝備奠定基礎(chǔ)。

海洋生物種類豐富多樣，是開發(fā)生物材料的天然寶庫，許多海底生物所具有的特殊性能也賦予了研究學(xué)者諸多的研究靈感。盡管海岸邊海浪不斷，但是海洋貽貝依然表現(xiàn)出了強大的濕黏附能力。貽貝黏附蛋白中的鄰苯二酚基團是其擁有濕黏附能力的關(guān)鍵。受貽貝黏附蛋白的啟發(fā)，研究人員研制了各種類型的聚合物模擬物，如聚乙烯亞胺-鄰苯二酚、殼聚糖-鄰苯二酚以及其他相關(guān)的鄰苯二酚聚合物[3]。

鄰苯二酚基團來源廣泛，是一種多功能單體，常用于合成黏合劑和涂料。鄰苯二酚及其衍生物與有機或無機基質(zhì)相互作用近年來吸引了學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。Hofman 等[5]合成了具有接枝兒茶酚基團的聚氧雜環(huán)丁烷共聚物，鄰苯二酚基團占15.5%（摩爾比）的聚合物對磨砂不銹鋼基體展示出5.59 MPa 的超強黏附作用，但是其潮濕表面的黏附能力顯著降低。Matos-Perez 等[6]合成了聚（3，4-二羥基苯乙烯-苯乙烯）共聚物，其在干燥表面黏合強度達到11 MPa，但是水下黏合強度僅為0.3 MPa。Lee 等[7]和Kahn 等[8]認為含有鄰苯二酚的分子很容易被氧化為活性醌，活性醌可以發(fā)生自聚反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。除此之外，鄰苯二酚基團也可以與膠原相互作用，其常常被引入膠原中以改善膠原性質(zhì)。

膠原是一種細胞外基質(zhì)蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱和血管等組織中。膠原分子可以自身交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)，形成的網(wǎng)絡(luò)限制了溶劑的運動，導(dǎo)致膠原蛋白溶液可以轉(zhuǎn)化為水凝膠。膠原水凝膠具有高度膨脹的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以有效地負載生物活性分子和傳遞質(zhì)量。并且膠原水凝膠具有免疫原性低、生物活性好等優(yōu)點，常用作各種組織器官的藥物或組織工程給藥系統(tǒng)。然而，膠原水凝膠的一些缺點，如機械強度差、降解率快和熱穩(wěn)定性低限制了膠原水凝膠的發(fā)展和應(yīng)用。Koob 等[9]使用二鄰苯二酚去甲二氫愈創(chuàng)木酸交聯(lián)膠原纖維，使膠原纖維的剛度從1 MPa 增加到約582 MPa，其力學(xué)性能與正常肌腱相當(dāng)。Luo 等[10]構(gòu)建了一種兒茶酚/膠原共聚物膜，用于裝載一氧化氮供體。然而，關(guān)于兒茶酚及其衍生物修飾的膠原水凝膠的研究較少。Zhu 等[11]用聚多巴胺對膠原水凝膠進行了改性，但結(jié)果并不令人滿意，膠原水凝膠的彈性模量僅提高到250 Pa。Duan 等[12]結(jié)合戊二醛在增強膠原性質(zhì)方面的高效性，發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚衍生物修飾的膠原能獲得具有理想性質(zhì)的水凝膠。其將3，4-二羥基苯甲醛（3，4-dihydroxybenzaldehyde，DB）加入膠原蛋白溶液中，然后用高碘酸鈉（NaIO4）將DB 的鄰苯二酚基團氧化成醌，活性醌在膠原分子間聚合并形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進而形成膠原水凝膠。研究結(jié)果表明，添加DB 使水凝膠的形態(tài)更加致密，抗酶性顯著增強。此外，細胞增殖試驗結(jié)果表明，膠原水凝膠與DB 具有良好的生物相容性。這些數(shù)據(jù)表明，這種鄰苯二酚衍生物修飾的新型膠原水凝膠具有巨大的應(yīng)用潛力，但是鄰苯二酚衍生物修飾膠原的水凝膠在止血方面的研究還未被探索。

基于此，本研究擬利用貽貝仿生技術(shù)，模擬貽貝黏附蛋白，以3，4-二甲氧基苯乙烯（3，4-dimethoxystyrene，DMS）和4-乙烯基苯甲酸（4-vinyl benzoic acid，VBA）為原料合成鄰苯二酚共聚物P（DHS-co-VBA）。用聚苯乙烯骨架代替黏附蛋白中的聚酰胺鏈，在骨架上接枝鄰苯二酚來模擬黏附蛋白中的3，4-二羥基苯乙烯濕黏附基團。之后與微纖維膠原進行結(jié)合，探索通過仿生技術(shù)提升膠原的組織黏附性能，檢測復(fù)合材料的生物相容性，并通過體外凝血檢測、動物止血模型進一步評價其在高濕環(huán)境的止血效果[13]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

實驗材料包括DMS、VBA、過硫酸鉀（K2S2O8）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化鈉（NaCl）、氯化氫（HCl）、三溴化硼（BBr3）、二甲基亞砜（dimethyl sulfo-xide，DMSO）、氯化鈣（CaCl2）和甲醇（CH4O），均來自阿拉丁公司。

實驗儀器包括凝膠滲透色譜儀（GPC 1515，Waters，美國）、核磁共振波譜儀（AVANCE 400，BRUKER，德國）、傅里葉紅外光譜分析儀（Nicolet 380，Thermo，美國）、表面張力測量儀（OCA20，Dataphysics，德國）、微機控制電子萬能試驗機（C42.503，美斯特，中國）、低溫恒溫反應(yīng)浴槽（XHDHJF-8002，霄漢，中國）。

1.2 樣品制備

由于鄰苯二酚基團中的羥基十分活躍，在制備過程中首先通過甲氧基將鄰苯二酚基團中的羥基保護起來，隨后對甲氧基進行脫保護，得到實驗所需要的羥基。

（1）聚[（3，4-二甲氧基苯乙烯）-共聚-4-（乙烯基苯甲酸）][P（DMS-co-VBA）]制備。

首先利用固相萃取柱將VBA 中多余的阻聚劑去除。將1 g DMS 和5 mL VBA 加入裝有60 mL 蒸餾水的三口燒瓶中進行乳液聚合反應(yīng)。反應(yīng)物加熱至60 ℃后，將64 mg 引發(fā)劑K2S2O8溶解在2 mL 水中后滴加至三口燒瓶中，并在氬氣保護的氛圍下于60 ℃攪拌24 h 后加入1 mL CH4O 終止聚合。進一步加入5 g NaCl 破乳沉淀，通過離心得到固體不溶物[14]，再使用CH4O 溶解后離心得到沉淀。此操作重復(fù)2～3次后，將得到的沉淀通過冷凍干燥劑除去多余的液體后，得到P（DMS-co-VBA）粉末。P（DMS-co-VBA）合成示意圖如圖1 所示。

圖1 P（DMS-co-VBA）合成示意圖

（2）P（DHS-co-VBA）的制備。

將2 g P（DMS-co-VBA）粉末溶解在50 mL CH2Cl2中。在氬氣保護的氛圍下，將反應(yīng)溫度冷卻至-10 ℃，維持10 min，然后在10 min 內(nèi)逐滴加入3 mL BBr3，并不斷攪拌。用300 mL 的1%HCl 分3 次重復(fù)洗滌處理該聚合物，然后在80 ℃烘箱干燥得到共聚物P（DHS-co-VBA）固體顆粒。P（DHS-co-VBA）合成示意圖如圖2 所示。

圖2 P（DHS-co-VBA）合成示意圖

（3）共聚物/膠原水凝膠制備。

將20 mg 的P（DHS-co-VBA）固體顆粒溶解在DMSO 與去離子水的混合溶劑中（體積比1∶1），加入一定質(zhì)量的微纖維膠原，攪拌共混，然后在80 ℃烘箱蒸發(fā)部分溶劑，制得P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠。

1.3 材料物化性能的表征

1.3.1 凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）

首先將待測樣品提前1 d 用氘代DMSO 溶劑溶解，之后將柱溫設(shè)置為40 ℃、檢測室的溫度設(shè)置為40 ℃，用普魯士多糖作為標準物質(zhì)，將示差檢測器的流速設(shè)置為1 mL/min 后，用凝膠滲透色譜儀進行檢測。

1.3.2 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）氫譜

使用干燥、清潔、高質(zhì)量的核磁管，以避免污染樣品及勻場過程中引入不必要的麻煩。對樣品進行充分的干燥和提純，避免雜質(zhì)峰掩蓋有用信號，同時樣品中不能混有磁性雜質(zhì)，否則會扭曲磁場而降低譜峰的分辨力。用5～10 mg 固體樣品蓋住核磁管底部后，用氘代DMSO 試劑0.5 mL 進行溶解，氘代試劑溶解后用核磁共振波譜儀進行氫譜的測試，并掃描16 次得到NMR 氫譜。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）

使用溴化鉀壓片法，先將樣品置于80 ℃干燥箱充分干燥后，取少量樣品以1∶100 的比例與溴化鉀在研缽中混勻后置于不銹鋼壓模中壓片成型，之后采用傅里葉紅外光譜分析儀對樣品進行紅外光譜分析，以分辨力0.09 cm-1、掃描范圍4000～400 cm-1觀察樣品對波譜的吸收情況。

1.4 親疏水性檢測

打開接觸角測試儀和相連接的計算機，滴液量盡量控制在1～5 μL 以內(nèi)，因為滴液過多，液滴受重力影響會產(chǎn)生變化，不是一個正規(guī)的圓形或者橢圓形，影響測試結(jié)果。將樣品置于樣品臺上，需根據(jù)實際操作情況調(diào)節(jié)光源明暗度，太亮?xí)?dǎo)致液滴外輪廓不清晰，太暗則導(dǎo)致液滴變大或者周圍太多黑點，影響測試數(shù)據(jù)的準確性。打開軟件后進行自動滴液，然后上升樣品臺接液基線位置，原則上一鍵式測量是自動找出基線進行測試，特殊情況無法識別出基線的，需要操作人員手動找尋基線。接液完成后，完成水接觸角的測試。

1.5 樣品干濕黏附強度分析

以玻璃作為干表面的黏附基底、浸水豬皮作為濕組織表面的黏附基底，從市場購買聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）型和環(huán)氧樹脂型黏合劑，通過設(shè)計搭接剪切對比實驗測試P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠的黏附強度[5]，具體操作如下：

截取2 塊尺寸為70 mm×25 mm 的黏附基底，將0.5 mL（0.1 g/mL）的膠黏劑溶液涂在一塊基底上。然后將涂有膠黏劑的部分搭接在一起，輕輕揉搓使混合均勻（搭接面積為25 mm×25 mm）。24 h 后對涂有膠黏劑的基底進行搭接剪切測試，拉伸速率為2 mm/min，直到2 塊基底被拉開[15]。搭接剪切強度的計算公式為a=P/（b×c），式中，a 為搭接剪切強度（MPa）；P 為最大拉伸作用力（N）；b 和c 分別為搭接區(qū)域的長度和寬度（mm）。

1.6 樣品細胞毒性測試

1.6.1 細胞增殖率

利用小鼠成纖維細胞進行毒性試驗，設(shè)計磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）對照組及4組P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品實驗組，并選用細胞毒性實驗中常用的2 個濃度進行試驗。其中實驗組1 為10 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）樣品（與細胞孵育后濃度），實驗組2 為10 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品，實驗組3為50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）樣品，實驗組4 為50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品。每組設(shè)置4 組平行實驗進行測試[16-18]，具體操作如下：

（1）將1×104個小鼠成纖維細胞接種在杜爾貝科培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中，并在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育24 h。

（2）去除原培養(yǎng)液，將一定體積的細胞（密度為2500 個/cm2）放置于24 孔板中，共計2 板，培養(yǎng)基為DMEM 加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、10%的胎牛血清。在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。

（3）加入細胞計數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8），孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基，并替換為150 μL的DMSO，使用酶標儀檢測細胞增殖率[19]。

1.6.2 死活細胞染色

死活細胞染色具體操作如下：

（1）將1×104個小鼠成纖維細胞接種在DMEM中，在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育24 h。

（2）去除原培養(yǎng)液，將一定體積的細胞（密度為2500 個/cm2）放置于24 孔板中，共計1 板，培養(yǎng)基為DMEM 中加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、10%的胎牛血清。在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

（3）加入死活細胞染色劑鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（一種具有細胞膜滲透性的活細胞熒光染料，呈綠色熒光）和碘化丙啶（其僅能穿過死細胞膜的無序區(qū)域到達細胞核，嵌入細胞的DNA 雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光）。在37 ℃水浴下孵育15 min 后，使用熒光顯微鏡放大50 倍捕獲圖像。

1.7 樣品止血性能測試

1.7.1 體外全血凝固時間（CBT）檢測

CBT 是一種能直觀反映凝血性能的基礎(chǔ)性檢測。在新西蘭兔的血液樣本中加入3.8%的檸檬酸鈉，實驗開始時，在3 個5 mL 玻璃管中分別加入20 mg P（DHS-co-VBA）[P（DHS-co-VBA）組]、20 mg 微纖維膠原（膠原組）、10 mg 微纖維膠原與10 mg P（DHS-co-VBA）（樣品組），空白對照組中不添加任何物質(zhì)。然后在37 ℃水浴下孵育5 min，取1 mL 兔血與樣品混合，37 ℃水浴下孵育3 min，取0.5 mL 0.025 mol/L 的CaCl2水溶液加入管中觸發(fā)凝血，將試管從水浴中取出，每隔15 s 倒轉(zhuǎn)1 次，直到試管中的血液不再流動[20]。

1.7.2 兔肝損傷模型止血實驗

設(shè)置空白對照組、膠原實驗組和P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實驗組，每組3 只白兔?？瞻讓φ战M不添加任何止血材料，膠原實驗組微纖維膠原用量為0.2 g，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠組利用注射器將1 mL 的樣品注入到傷口表面，其中樣品中P（DHS-co-VBA）和微纖維膠原各0.1 g。實驗前1 d，所有白兔必須禁食，但是不禁水。實驗前，將白兔以仰臥的形式固定在實驗手術(shù)臺上，肌肉注射10%的陸眠寧，用藥量0.75 mL/kg；待白兔麻醉后，在腹部作備皮處理并且進行酒精消毒；隨后沿中線剖腹，將兔肝組織完全暴露，用無菌紗布吸去多余的腹水及血液。在兔肝上葉取下直徑約1.2 cm、深度約1 mm 的組織，形成出血創(chuàng)面；在傷口自然出血3 s 后，用無菌紗布吸去流出的血液，然后立即將止血材料完全覆蓋于創(chuàng)面，如圖3 所示。隨后每隔30 s觀察一次出血情況，用已稱重的無菌紗布吸去創(chuàng)面周圍滲血，當(dāng)在止血材料表面觀察不到有血液滲出，且保持30 s 仍然不再出血時，認為出血已得到控制，實驗結(jié)束，并記錄下止血時間[21]。取下傷口處的止血材料及無菌紗布后進行稱重，根據(jù)所用敷料的原始質(zhì)量和止血后質(zhì)量的差值，計算失血量。

圖3 兔肝損傷模型止血實驗

2 結(jié)果

2.1 材料的物化性能表征結(jié)果

2.1.1 GPC

通過對圖4 進行分析處理可以得到GPC 的結(jié)果，結(jié)果顯示，P（DHS-co-VBA）的數(shù)均分子量為5023，重均分子量為7162，黏均分子量為6771，P（DHS-co-VBA）的多分散性指數(shù)為1.42584，分散性較好，證明聚合物已成功制備。

圖4 P（DHS-co-VBA）分子量的分布曲線

2.1.2 NMR 氫譜

如圖5 所示，NMR 氫譜與目標聚合物一致，其中化學(xué)位移ppm 6.5～8 為苯環(huán)上H 的位移，ppm 12.9左右為羧基H 位移，P（DMS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果中ppm 3.5～4 表現(xiàn)為甲氧基的H 的位移，而該位置的峰在圖6 中P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果中消失，同時P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果同時出現(xiàn)酚羥基的位移峰。說明P（DHS-co-VBA）已成功脫去甲氧基，在還原的過程中，鄰苯二酚基團裸露在外。

圖5 P（DMS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果

圖6 P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果

2.1.3 FTIR

P（DMS-co-VBA）與P（DHS-co-VBA）的FTIR圖顯示（如圖7 所示），P（DHS-co-VBA）在1200～1300 cm-1和2500～2800 cm-1處有吸收峰，這表明P（DHS-co-VBA）共聚物表面含有大量的羧基、羥基活性基團。P（DMS-co-VBA）在2950 cm-1處的甲氧基吸收峰在還原過程中消失，也證實了鄰苯二酚基團的成功制備。

圖7 P（DMS-co-VBA）與P（DHS-co-VBA）的FTIR 圖

2.2 親疏水性檢測

如圖8 所示，通過測試，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料水接觸角為73.5°，說明P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料較為親水，可能與P（DHS-co-VBA）表面含有大量的羧基與鄰苯二酚等親水性基團相關(guān)。

圖8 水接觸角檢測圖

2.3 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠形態(tài)及性能

如圖9 所示，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原呈水凝膠的形態(tài)，膠原因共聚物黏附力吸附在水凝膠的內(nèi)部及表面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原整體也有很強的黏附力，用手指拉伸一段距離后，呈絲狀連接。

圖9 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實物圖

2.4 樣品干濕黏附強度分析

由圖10 可知，以玻璃為黏附基底，PVC 型黏合劑的峰值平均載荷為（44.2±3.3）N[如圖10（a）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（70.7±5.2）kPa；環(huán)氧樹脂型黏合劑的峰值平均載荷為（326.4±16.6）N[如圖10（b）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（522.3±26.6）kPa；P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的峰值平均載荷為（117.4±7.8）N[如圖10（c）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（187.9±12.5）kPa。由圖10（d）可知，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的黏附強度高于PVC 型黏合劑，低于環(huán)氧樹脂型黏合劑。由此說明P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品在干表面具有一定的黏附強度。

由圖11 可知，在浸水豬皮黏附基底黏附強度檢測中，PVC 型黏合劑的峰值平均載荷為（8.6±0.8）N[如圖11（a）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（13.8±1.3）kPa；環(huán)氧樹脂型黏合劑的峰值平均載荷為（8.8±3.0）N[如圖11（b）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（14.1±0.4）kPa；P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的峰值平均載荷為（114.3±3.9）N[如圖11（c）所示]，經(jīng)過計算搭接剪切的強度為（182.8±6.3）kPa。由圖10（d）與圖11（d）發(fā)現(xiàn)，制備的P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品具有較強的濕黏附性能，基本與干表面的黏附強度一致，而市售的黏合劑雖然在干表面表現(xiàn)出很強的黏附效果，但是在濕表面表現(xiàn)不佳。

圖10 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品與其他樣品在玻璃干表面的黏附強度測試結(jié)果

圖11 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品與其他樣品在浸水豬皮表面的黏附強度測試結(jié)果

2.5 樣品細胞毒性測試結(jié)果

2.5.1 細胞增殖率

如圖12 所示，當(dāng)細胞與檢測樣品孵育24 h 后，通過吸光度檢測計算PBS 對照組的細胞存活率接近100%，10 與50 mg/mL 所有實驗樣品的細胞存活率均大于90%，說明制備的P（DHS-co-VBA）及P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的細胞毒性低，生物相容性良好。即使在50 mg/mL 的濃度下，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料也表現(xiàn)出良好的生物相容性，細胞毒性均小于2 級。

圖12 CCK-8 細胞毒性檢測結(jié)果

2.5.2 死活細胞染色結(jié)果

如圖13 所示，死活細胞染色結(jié)果與細胞存活率測試結(jié)果一致，可以明顯地看出，50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）及50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠只有少部分的細胞死亡，同樣證實了制備的水凝膠材料具有很好的細胞相容性。

圖13 死活細胞染色結(jié)果（鈣黃綠素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶染色，50×）

2.6 樣品止血性能測試結(jié)果

2.6.1 CBT 檢測

如圖14 所示，空白對照組的凝血時間為（69.0±3.6）s，P（DHS-co-VBA）組的凝血時間為（61.3±7.8）s，膠原組的凝血時間為（68.7±1.5）s，樣品組的凝血時間為（63.7±5.7）s。雖然經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，P（DHS-co-VBA）組、膠原組以及樣品組都與空白對照組無顯著性差異，但是通過凝血時間數(shù)據(jù)對比可以發(fā)現(xiàn)，單純的微纖維膠原材料幾乎并未改變兔血的凝血時間，而P（DHS-co-VBA）可以縮短兔血的凝血時間，同樣P（DHSco-VBA）與微纖維膠原的混合物也可以縮短兔血的凝血時間，只是縮短時間的效果未達到顯著差異。說明復(fù)合水凝膠具備一定的凝血效果，且較單一的微纖維膠原樣品凝血效果進一步提升，說明P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠有助于實現(xiàn)血液的凝固，可能與鄰苯二酚基團產(chǎn)生的濕黏附效果有關(guān)。

圖14 CBT 檢測結(jié)果

2.6.2 兔肝損傷模型止血實驗

由表1、圖15 和圖16 可以看出，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實驗組的平均止血時間為（182.7±34.8）s，平均失血量為（2.097±0.966）g；膠原實驗組的平均止血時間為（191.3±27.3）s，平均失血量為（2.569±0.404）g。在止血時間方面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實驗組基本與膠原實驗組一致并且遠低于空白對照組；在失血量方面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實驗組遠低于空白對照組，略低于膠原實驗組。由于微纖維膠原在止血過程中吸收了大量的血液并凝結(jié)，在后續(xù)失血計算中難以估算材料內(nèi)部吸收的血量，因此實際失血量要比可計算的失血量的數(shù)值還要大。整體而言，P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料在止血性能方面優(yōu)于純微纖維膠原。

圖16 各組失血量對比

表1 各組止血時間及失血量測試結(jié)果

圖15 各組止血時間對比

3 結(jié)語

本研究合成了鄰苯二酚類的仿生濕黏材料，并與微纖維膠原材料復(fù)合制備了水凝膠材料，探索了鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠材料在濕面組織的黏附強度和止血性能，并從生物相容性、體外凝血和動物創(chuàng)傷模型3 個方面評價了鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠作為止血材料的可行性。研究結(jié)果表明，鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠止血材料在高強黏附、快速止血、封閉創(chuàng)面方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，有望實現(xiàn)戰(zhàn)創(chuàng)傷快速止血，進一步提升我軍的衛(wèi)勤保障能力。

本研究還有些許不足：（1）微纖維膠原與P（DHSco-VBA）是共混方式，并不是十分穩(wěn)定，如果采用共價連接會使材料更加穩(wěn)定。（2）P（DHS-co-VBA）在水中溶解性差，需將P（DHS-co-VBA）溶解在有機試劑中使用，因此會影響共聚物的細胞毒性。因此下一步的研究方向是首先制備可溶于水的鄰苯二酚共聚物，并利用微纖維膠原與共聚物中的活性基團共價耦連，持續(xù)優(yōu)化制備工藝，研制濕黏附強度更大的聚合材料。其次因為強大的黏附效果必然加大黏附劑在傷口處的剝離難度，因此需研制一種黏附性能可控的止血材料，實現(xiàn)黏附強度的精準調(diào)控。