高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)奶粉中倍他米松殘留量的方法研究

智麗慧

（上海妙可藍(lán)多食品科技股份有限公司，上海 201506）

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids，GCs）是一類甾體激素，又名“腎上腺皮質(zhì)激素”，能夠調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)等成分的合成和代謝，臨床上廣泛應(yīng)用于治療皮膚過(guò)敏性及炎癥性疾病，且糖皮質(zhì)激素能提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)而被用于動(dòng)物養(yǎng)殖[1]。倍他米松作為糖皮質(zhì)激素重要成員，具有消炎、抗病毒、促進(jìn)泌乳等多種功效，倍他米松為地塞米松的同分異構(gòu)體，作用與用途同醋酸地塞米松，其鈉水潴留作用及劑量都比后者小，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用[2]。

質(zhì)譜技術(shù)起源于19世紀(jì)英國(guó)學(xué)者湯普森發(fā)明的質(zhì)譜儀，當(dāng)時(shí)是用于檢測(cè)分子質(zhì)量差異，分辨率較低；隨著質(zhì)譜儀技術(shù)的提升，分辨率逐步提高，當(dāng)高效液相色譜技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用后，既有高效液相色譜技術(shù)對(duì)復(fù)雜化合物的良好分離能力，又綜合了高分辨率質(zhì)譜對(duì)化合物的準(zhǔn)確定性和定量，還可在很大程度上縮減分析時(shí)間。高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，可實(shí)現(xiàn)多種化合物的同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果的靈敏度高、準(zhǔn)確性好，廣泛應(yīng)用于食品、藥品等檢測(cè)領(lǐng)域[3]。

在食品檢測(cè)行業(yè)中，高效液相色譜-質(zhì)譜法可以準(zhǔn)確高效地測(cè)定乳制品中三聚氰胺含量、農(nóng)藥殘留量、獸藥殘留量、食品添加劑含量和毒素含量，其檢測(cè)速度快，定性、定量分析的準(zhǔn)確性高，該方法補(bǔ)齊了常規(guī)檢測(cè)方法的短板，在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣，但還有很大的技術(shù)應(yīng)用空間。目前，倍他米松的主要檢測(cè)方法是農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008《動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[4]。多組分同時(shí)處理時(shí)，倍他米松回收率偏低，本研究通過(guò)優(yōu)化前處理方法、色譜條件、改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行快速篩查，以期對(duì)乳制品中倍他米松篩查和確證提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

購(gòu)買不同到貨批次的全脂奶粉20批；倍他米松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CAS：378-44-9，純度大于等于99%）；甲醇、甲酸、乙腈，均為色譜純；試驗(yàn)用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters TQD型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配Waters高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、電噴霧離子源；Oasis HLB cartridge固相柱（3 mL/60 mg）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

使用直接稱量方式稱取1 g奶粉樣品（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，再向上述具塞離心管中加入約45 ℃ 10 mL水，漩渦1 min使奶粉樣品完全溶解成勻液。再向具塞離心管中加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，以≥5 000 r/min離心10 min，使用一次性移液管取上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，將蒸發(fā)瓶安裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，使用45 ℃水浴減壓蒸發(fā)，將上清液濃縮至體積小于5 mL。再將濃縮后的提取液全部轉(zhuǎn)移至經(jīng)活化的C18固相萃取柱，用5 mL水少量多次洗滌旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶和萃取柱，萃取柱在負(fù)壓下減壓抽干1 min，流出液全部棄去。使用5 mL乙腈作為洗脫劑，以≤3 mL/min流速進(jìn)行洗脫，使用玻璃試管收集洗脫液，將玻璃試管置于45 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑傧虿Ａг嚬苤屑尤?.50 mL流動(dòng)相，漩渦溶解殘?jiān)?，?.22 μm的濾膜過(guò)濾待測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

倍他米松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱?。?00±1）mg倍他米松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇進(jìn)行溶解，分少量多次將溶解液體轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶并定容，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。倍他米松標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液：吸取適量的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇配成1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液。

倍他米松標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別吸取20 μL、50 μL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL倍他米松標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液，用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為0.2 μg/L、0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的系列工作液

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：XBridge C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈+0.1%甲酸溶液（1+1）；流速：200 μL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源ESI+，毛細(xì)管電壓2.6 kV，離子源溫度110 ℃，錐孔反吹氣流量35 L/h，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流量750 L/h。第一重四極桿和第二重四極桿的低端分辨率及高端分辨率均為15。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

本研究比較以乙腈和乙酸乙酯為提取劑提取試樣中倍他米松。選擇4組陰性基質(zhì)樣品，分別向上述4組樣品中添加2 μL、3 μL、5 μL和10 μL標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液制備成濃度為2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加標(biāo)樣品，每組2個(gè)平行，分別使用乙腈和乙酸乙酯為提取劑，提取結(jié)果見表1。結(jié)果表明以乙酸乙酯為提取劑，倍他米松回收率偏低，無(wú)法達(dá)到《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F回收率范圍的要求[5]；以乙腈為提取劑進(jìn)行提取時(shí)，由于乙腈具有使蛋白質(zhì)變性的特性，提取效果好，回收率結(jié)果符合要求。故采用乙腈作為提取劑，能夠有效去除蛋白質(zhì)等，有利于下一步的凈化與濃縮。

表1 不同提取劑提取倍他米松的結(jié)果對(duì)比表

2.2 線性關(guān)系

按儀器工作條件及優(yōu)化后條件對(duì)倍他米松標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。倍他米松在0.2～10.0 μg/L線性良好，線性回歸方程為y=1.336x-1.179，相關(guān)系數(shù)為0.999 7。

2.3 方法檢出限

采用經(jīng)確認(rèn)為陰性的基質(zhì)樣品，添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品按照1.3方法處理并測(cè)定，以大于3倍和10倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限和定量限。倍他米松的檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

分別稱取5份奶粉樣本，1份作為試樣本底，分別在另外4份中添加不同量倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成理論添加量分別為2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加標(biāo)樣品，對(duì)5份試樣測(cè)定，方法的平均回收率為65.0%～86.0%，方法回收率在60%以上，可滿足檢測(cè)要求，結(jié)果見表2。

表2 倍他米松加標(biāo)回收率結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

選取倍他米松未檢出的陰性試樣，按照1.3.1方法稱取24份試樣，分為4組，每組6個(gè)平行，每組添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.29%～13.76%，方法的精密度在15%以內(nèi)，可滿足檢測(cè)要求，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)20批奶粉樣品用優(yōu)化后方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)附帶加標(biāo)回收的質(zhì)量控制方式，在回收率符合的情況下，奶粉試樣結(jié)果均未檢出。

3 結(jié)論與討論

本文建立了奶粉中倍他米松的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法?；凇杜Ｄ毯湍谭壑械厝姿蓺埩袅康臏y(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB/T 22978—2008）[6]的前處理步驟，該方法優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，使用乙腈作為提取劑，檢出限和定量限均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，曲線線性表現(xiàn)良好，回收率和精密度也均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)應(yīng)用奶粉實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程未發(fā)現(xiàn)異常。因此，該方法可適用于奶粉中倍他米松的篩查測(cè)定；另外該方法應(yīng)用的提取劑與測(cè)定奶粉中地塞米松殘留量的提取劑一致，可進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用奶粉中地塞米松和倍他米松的同時(shí)測(cè)定。