分光光度法測(cè)定奶酪中亞硝酸鹽含量的不確定度評(píng)定

鄔 婧

（北京市朝陽(yáng)區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100124）

很多食物中都含有亞硝酸鹽，亞硝酸鹽對(duì)人的身體有一定的危害，新聞中報(bào)道的由亞硝酸鹽引發(fā)食物中毒的事件不在少數(shù)[1-2]。我國(guó)對(duì)亞硝酸鹽的使用和安全管理有著嚴(yán)格要求，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用亞硝酸鹽是安全的。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定亞硝酸鈉、亞硝酸鉀可作為護(hù)色劑、防腐劑在腌臘肉制品、醬鹵肉制品和熏、燒、烤肉等加工中使用，并規(guī)定了最大使用量和最大殘留量。以下對(duì)奶酪亞硝酸鹽不確定度測(cè)定工作中分光光度法的應(yīng)用及不確定性來(lái)源進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售奶酪，隨機(jī)購(gòu)買。3%乙酸溶液、4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液；2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液；200 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)GBW(E)100156]。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；ME203分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；并根據(jù)要求對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）中的第二法分光光度法進(jìn)行測(cè)定。將樣品研磨成均勻的泥漿狀，混合均勻。稱取試樣2.5 g（精確至0.001 g），將選取好的樣品置于150 mL具塞錐形瓶中。加水80 mL后搖勻，超聲30 min后取出放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入3%乙酸溶液2 mL，加水稀釋至刻度，混合均勻。于4 ℃放置20 min，取出放置至室溫，溶液經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾，濾液備用。

1.3.2 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

吸取40 mL濾液于50 mL帶塞比色管中，另吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg/mL）0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL和2.50 mL。然后對(duì)樣品進(jìn)行處理，在試管中加入2 mL的4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度線，混勻后靜置15 min。用1 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做空白對(duì)照[4]。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型

式中：x為樣品中亞硝酸鹽含量，mg/kg；V1為樣本溶液的總體積，mL；V2為樣本測(cè)試液(原液)的體積，mL；m1為試樣質(zhì)量，g；m2為測(cè)定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，μg。

1.3.4 不確定度來(lái)源分析

不確定度來(lái)源包括測(cè)定樣品中亞硝酸鹽平均值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[3]、稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、試樣液總體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、測(cè)定用樣液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、測(cè)定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2 不確定度的評(píng)定

2.1 測(cè)定樣品中亞硝酸鹽平均值引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實(shí)驗(yàn)對(duì)奶酪中亞硝酸鹽含量進(jìn)行6次測(cè)定，測(cè)量值分別為1.298 mg/kg、1.323 mg/kg、1.302 mg/kg、1.319 mg/kg、1.322 mg/kg及1.302 mg/kg，平均值為1.311 mg/kg，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.011 5，則測(cè)定平均值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱量樣品的平均質(zhì)量為2.502 g，根據(jù)天平的檢定證書(shū)可知，稱量質(zhì)量在0～50 g時(shí)，U=1.0 mg，k=2，則稱量產(chǎn)生引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 試樣液總體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）對(duì)樣品的定容引入不確定度進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)100 mL容量瓶的檢定證書(shū)可以得出，容量瓶在進(jìn)行擴(kuò)展的時(shí)候擴(kuò)展的不確定度是U=0.020 mL，k=2。得出樣品的定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）溫度引入的不確定度。將實(shí)驗(yàn)的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環(huán)境進(jìn)行條件反應(yīng)的時(shí)候，水的體積的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計(jì)算為：

（3）合成上述兩項(xiàng)不確定度分量，試樣液總體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

試樣液總體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 測(cè)定用樣液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）移液過(guò)程引入的不確定度，選擇樣品液的劑量為40 mL，用5 mL的移液器，分8次進(jìn)行提取。在選擇容器的時(shí)候，容器的擴(kuò)展度U=0.1%，k=2，則吸取樣液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實(shí)驗(yàn)的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環(huán)境進(jìn)行條件反應(yīng)的時(shí)候，應(yīng)該仔細(xì)觀察水的體積的膨脹情況，此時(shí)水的體積的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計(jì)算為：

（3）合成上述兩項(xiàng)不確定度分量，測(cè)定用樣液體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

測(cè)定用樣液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5.1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為200 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)溶液證書(shū)提供的不確定度U=2%，k=2，標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度為：

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5.2 移液體積引入的不確定度

（1）用5 mL的移液器。在選擇容器的時(shí)候，容器的擴(kuò)展度U=0.1%，k=2，則吸取樣液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實(shí)驗(yàn)的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環(huán)境進(jìn)行條件反應(yīng)的時(shí)候，應(yīng)該仔細(xì)觀察水的體積的膨脹情況，此時(shí)水的體積的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計(jì)算為：

合成上述兩項(xiàng)不確定度分量，移液體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

移液體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5.3 定容體積引入的不確定度

（1）100 mL容量瓶引入的不確定度。從100 mL容量瓶的檢定證書(shū)中可以得出，容量瓶在進(jìn)行擴(kuò)展的時(shí)候擴(kuò)展的不確定度是U=0.020 mL，k=2。這一過(guò)程中樣品的定容是100 mL，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為：

（2）溫度引入的不確定度。將實(shí)驗(yàn)的溫度控制在20 ℃，在（20±5）℃的環(huán)境進(jìn)行條件反應(yīng)的時(shí)候，此時(shí)水的體積的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃。則由溫度引入的不確定計(jì)算為：

合成上述兩項(xiàng)不確定度分量，定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成上述3項(xiàng)相對(duì)不確定度分量，亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，在對(duì)這些度數(shù)進(jìn)行計(jì)算的時(shí)候，也應(yīng)該利用特定的公式和特定的算法用波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定，然后還應(yīng)該對(duì)波長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)展，仔細(xì)觀察波長(zhǎng)測(cè)量的數(shù)據(jù)，對(duì)于波長(zhǎng)的不確定性進(jìn)行記錄。然后應(yīng)該仔細(xì)觀察波長(zhǎng)測(cè)量的數(shù)據(jù)和紫外線可見(jiàn)光度的數(shù)據(jù)，利用特定的公式對(duì)紫外線可見(jiàn)光的光度進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而得出紫外線的不確定度。根據(jù)UV-2600紫外分光光度計(jì)的檢定證書(shū)為U=0.3 nm，k=2，計(jì)算儀器的不確定度為：

儀器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.7 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬定，對(duì)擬定標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度進(jìn)行計(jì)算。配制9個(gè)濃度分別為0 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL和12.5 μg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度法測(cè)量得到相應(yīng)的吸光值，得到直線方程Y=bx+a和其相關(guān)系數(shù)r，如表1所示。

表1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表

本實(shí)驗(yàn)得到的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.072 508 8x-0.015 731 0，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 61。根據(jù)擬合工作曲線有關(guān)的不確定度公式計(jì)算為[1]：

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣品濃度為1.311 mg/kg，則擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

針對(duì)以上分析的各個(gè)不確定度分量，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

取包含因子k=2，則測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為0.032 mg/kg[5]。該奶酪中亞硝酸鹽的結(jié)果是1.311 mg/kg，因此結(jié)果可表示為（1.311±0.032）mg/kg。

4 結(jié)論

總之，在對(duì)奶酪中的亞硝酸鹽含量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)算和提取的時(shí)候應(yīng)該利用相關(guān)的公式進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，如果包含因子是2，通過(guò)公式計(jì)算出最終奶酪中亞硝酸鹽含量的擴(kuò)展不確定度為0.032 μg/mL。實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)候，應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，同時(shí)對(duì)各類數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)的歸類和整理。應(yīng)該切實(shí)做好實(shí)驗(yàn)操作，嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。