胱抑素C在全自動生化分析儀上檢測的鉤狀效應(yīng)研究

林育婷

（英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司，福建廈門361000）

胱抑素C（Cystain C，Cys C）又名半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine Proteinase Inhibitor，CPI），是一種非糖基化的堿性蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量較小，在體內(nèi)唯一的代謝途徑是通過腎小球濾過排泄。自1985年以來，胱抑素C已被視為檢測腎功能的良好標志物，可作為腎小球濾過功能的監(jiān)測指標，是一種理想的內(nèi)源性標志物，在一系列生理病理過程中也發(fā)揮著作用，有重要的臨床意義[1]。

胱抑素C的測定方法很多，目前使用較廣泛的是在全自動生化分析儀上使用的透射免疫比濁法[2]。透射免疫比濁法的檢驗原理是反應(yīng)生成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，并產(chǎn)生一定的濁度，所以濁度值直接反映樣品中抗原的含量。透射免疫比濁法雖然具有操作簡單、測定速度快、無污染、自動化的優(yōu)勢，但在檢測高濃度標本時，會因抗原過量產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)使反應(yīng)信號減弱，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低[3]。不同品牌的檢測儀器，因信號量程、測定程序、數(shù)據(jù)分析模式等的不同，發(fā)生抗原過量鉤狀效應(yīng)的結(jié)果可能不同。本文對研制的胱抑素C試劑在兩種全自動生化分析儀上的鉤狀效應(yīng)結(jié)果進行比較，分析其對臨床結(jié)果造成偏差的風(fēng)險，并設(shè)法減小這種風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 材料

抗原，北京百川飛虹生物科技有限公司；抗體，購自DAKO公司；胱抑素C測定試劑，英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司；胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液，英科新創(chuàng)（廈門）科技股份有限公司。

1.2 儀器

Hitachi 7180全自動生化分析儀，吸光度測定量程-3.2～3.2，日本日立公司；Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀，吸光度測定量程-2.5～2.5，美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 測定程序

Hitachi 7180全自動生化分析儀測定程序：測定波長546 nm，測光點18～34，測定模式為兩點終點法，定標方式為6點定標（Logit-log（4P）擬合）。

Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀測定程序：測定波長540 nm，測光點14～27，測定模式為終點法，定標方式為6點定標（Spline擬合）。

1.3.2 不同濃度梯度的胱抑素C抗原溶液的制備

將胱抑素C抗原用胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液復(fù)溶，配制成理論濃度為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L、12.0 mg/L、14.0 mg/L、16.0 mg/L、18.0 mg/L、20.0 mg/L、25.0 mg/L、30.0 mg/L、35.0 mg/L、40.0 mg/L、45.0 mg/L及50.0 mg/L的19個濃度梯度。

1.3.3 繪制劑量-效應(yīng)曲線

將上述19個濃度的胱抑素C抗原溶液分別在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上進行檢測，每個樣品重復(fù)檢測3次，以3次檢測結(jié)果的反應(yīng)吸光度均值為縱坐標，胱抑素C抗原溶液的理論濃度為橫坐標，用Excel表格做出相應(yīng)的散點圖和趨勢線，繪制成劑量-效應(yīng)曲線。根據(jù)曲線，對胱抑素C在兩種儀器上的鉤狀效應(yīng)進行比較分析。

1.3.4 鉤狀效應(yīng)差異的改善方法

分別采用不同濃度的抗體用量（75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L）配制胱抑素C試劑，按上述方法進行試驗，根據(jù)結(jié)果判斷是否能解決不同檢測儀器間鉤狀效應(yīng)差異的問題。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種儀器的劑量-效應(yīng)曲線

從圖1、圖2可以看出，不同抗體用量配制的胱抑素C試劑，在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上測定0～50 mg/L的不同濃度梯度的抗原溶液，均存在明顯的鉤狀效應(yīng)。樣品的反應(yīng)吸光度起初隨著抗原濃度的升高而升高，在到達平衡點濃度之后反應(yīng)吸光度隨著抗原濃度的升高反而減小。如圖1所示，當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和 150 mg/L時， 在7180分析儀上測定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結(jié)合達到平衡點時的抗原濃度（即HOOK濃度）分別約為 12 mg/L、14 mg/L、18 mg/L和 18 mg/L，超過以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢。如圖2所示，當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L時，在AU680分析儀上測定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結(jié)合達到平衡點時的HOOK濃度分別約為10 mg/L、12 mg/L、12 mg/L和10 mg/L，超過以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢。

圖1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在日立7180上的劑量-效應(yīng)曲線

圖2 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在AU680上的劑量-效應(yīng)曲線

2.2 鉤狀效應(yīng)差異分析

不同抗體用量配制的胱抑素C在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上雖然有類似的鉤狀效應(yīng)趨勢，但出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度有所區(qū)別：在7180分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度也有較明顯增加；在AU680分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度增加不明顯，且相同抗體用量配制的胱抑素C在AU680分析儀上的HOOK濃度均比在7180分析儀上低。此種情況的發(fā)生，可能為AU680儀器的測定量程較?。ㄗ畲鬁y定量程為2.5），當試劑抗體濃度大于125 mg/L時，反應(yīng)吸光度已接近儀器的最大量程，所以隨著抗體濃度的增加，儀器測定量程的限制可能影響了測定結(jié)果的準確性（見表1）。此外，儀器的加樣時間點、測光點、數(shù)據(jù)擬合方式不同，也可能是造成此種現(xiàn)象的原因[4]。

表1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度和反應(yīng)吸光度

有研究表明，試劑中抗體濃度越高，所能準確測量到的抗原濃度也越高，試劑安全報告范圍也越寬，鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)的概率會大大減小[5]。但試劑在臨床應(yīng)用上，需要適配多種型號的儀器，儀器的測量差異也應(yīng)是試劑研發(fā)過程中需要綜合考慮的。本產(chǎn)品胱抑素C試劑的線性范圍要求為0～8 mg/L，健康成人血清胱抑素C的參考范圍為0.59～1.03 mg/L，臨床患者血清胱抑素C濃度在12 mg/L以上的也較少，因此綜合考慮試劑的質(zhì)量要求、儀器的測量差異以及臨床檢測的需求，選擇本試劑的抗體濃度為100 mg/L。選擇此抗體濃度，在7180分析儀中的HOOK濃度約為14 mg/L，在AU680分析儀上的HOOK濃度約為12 mg/L，二者均超過試劑線性范圍要求的上限，對于在線性范圍之內(nèi)的樣本，均能保證檢測結(jié)果的準確性，也能覆蓋臨床常見的樣本濃度。

3 結(jié)論

鉤狀效應(yīng)是免疫比濁試劑不可避免的問題，本試劑在研發(fā)過程中，在優(yōu)化配方的同時，也綜合考慮了儀器的測量差異，根據(jù)研究結(jié)果確定了抗體的最佳用量。同時，通過此研究，對所研制的試劑有了更準確的HOOK效應(yīng)數(shù)據(jù)，以此指導(dǎo)臨床檢測過程中對抗原超限標本進行稀釋處理，避免在檢測過程中由于檢測儀器的不同而造成超高值標本檢測結(jié)果的不準確。