清香型白酒糟生物有機肥制備與肥效研究

趙佳，馮志威，田志剛，高振峰*

（1.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中 030619；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院） 食品科學(xué)與工程學(xué)院（農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所），山西太原 030031）

我國是蒸餾白酒的生產(chǎn)大國，山西省為清香型白酒的發(fā)源地，僅汾陽市杏花村鎮(zhèn)就有正規(guī)酒企17家，2020年產(chǎn)生的酒糟100余萬t。酒糟為白酒蒸餾取酒后的固態(tài)廢棄物，因其持續(xù)生產(chǎn)時間長、產(chǎn)量大、不易貯藏與運輸?shù)奶攸c，酒糟處理成為限制釀造企業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問題。目前，酒糟主要的處理方式為晾曬后作為動物粗飼料向周圍養(yǎng)殖戶售賣，但由于其價格低、經(jīng)濟效益差、需求量小等原因，部分酒糟被酒企直接丟棄。隨著釀酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，丟糟規(guī)模日益擴大，這不僅使得酒糟資源白白浪費，還對周圍的農(nóng)田與水源等環(huán)境造成了嚴重污染[1-4]。從白酒的釀造生產(chǎn)工藝來看，發(fā)酵過程中釀造微生物無法充分利用糧食物料中的所有營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是清香型白酒只進行兩輪發(fā)酵蒸餾取酒，相對于瀘州老窖與五糧液、茅臺與郎酒等濃香型與醬香型的白酒糟，蒸餾取酒后殘留的營養(yǎng)物質(zhì)（粗纖維、粗淀粉、粗蛋白、無氮浸出物、粗灰分和礦物質(zhì)元素等）含量仍然較高。另外，酒糟經(jīng)過高溫蒸煮后可以有效殺菌，因此可作為制作生物有機肥的理想原材料[5-6]。

生物有機肥由有機肥發(fā)展而來，是以經(jīng)過無害化處理、腐熟的畜禽糞污、糠醛渣、各種作物秸稈與菌糠等農(nóng)業(yè)固態(tài)廢棄物為原料，以具有拮抗病原菌、促進作物生長等功能的特定微生物為發(fā)酵劑，進行二次發(fā)酵制成的兼具有機肥作用和微生物功效的一類肥料，與其他肥料相比具有穩(wěn)效、長效、高效3大突出優(yōu)點[7-8]。車艷麗等[9]以貴州茅臺鎮(zhèn)的醬香型白酒糟為底物制作栽培基質(zhì)，以番茄為供試作物，研究酒糟基質(zhì)對番茄生長及其品質(zhì)的影響。結(jié)果顯示，酒糟基質(zhì)相比普通基質(zhì)中有機質(zhì)和總養(yǎng)分含量高，種植過程中番茄生物量、產(chǎn)量明顯高于對照，果實品質(zhì)顯著提高。李哲等[10]以瀘州老窖蒸餾取酒后的酒糟為原料，利用高溫發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)有機肥，以高粱作為供試作物，研究其對高粱的肥效。結(jié)果表明，施用該肥料后高粱產(chǎn)量比對照組提高了12.55%，籽粒含氮量比對照組增加了36.70%，植株磷、鉀吸收量分別比對照組上升了22.22%和29.20%，說明該有機肥的肥效顯著。目前，既能解決清香型白酒糟無害化處理問題又能實現(xiàn)酒糟的大規(guī)模資源化利用的方法已成為學(xué)界研究的熱點，而利用特定功能微生物菌劑將其發(fā)酵制成生物有機肥還未見相關(guān)報道，筆者利用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的微生物復(fù)合菌劑對清香型白酒糟進行二次發(fā)酵制成酒糟生物有機肥并對其肥效進行研究，為酒糟生物有機肥的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌種為解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1及微白黃鏈霉菌G-1，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)科院）保藏，前期試驗證明3種菌株都具有一定的拮抗病原菌與促進植株生長的功效[11-13]；供試黃瓜品種為“津優(yōu)35號”，供試地點為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)科院）東陽試驗基地，位于山西省晉中市；供試酒糟，由山西杏花村國賓白酒有限公司提供；供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基，配方見參考文獻[14]。

1.2 儀器與設(shè)備

SN-CJ-1G型超凈工作臺，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；SN-SPX-80/150型恒溫培養(yǎng)箱，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；XFS-260型雙閥門滅菌鍋，上海尚儀儀器設(shè)備有限公司；DDS-11A型電導(dǎo)率儀，上海雷磁儀器有限公司；HH420型恒溫數(shù)顯水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；7230G型光譜儀、7230G型分光光度計，上海菁華儀器有限公司。

1.3 菌劑制備

將保存的解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1及微白黃鏈霉菌G-1菌種接入斜面培養(yǎng)基活化，解淀粉芽孢桿菌CM3和解淀粉芽孢桿菌Lh-1使用NA培養(yǎng)基活化，微白黃鏈霉菌G-1使用PDA培養(yǎng)基活化。活化后的菌株接入液體培養(yǎng)基進行擴繁培養(yǎng)，解淀粉芽孢桿菌CM3和解淀粉芽孢桿菌Lh-1培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，發(fā)酵36 h；微白黃鏈霉菌G-1培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min，發(fā)酵48 h。

1.4 清香型白酒糟生物有機肥制備

在清香型白酒糟中加入石灰粉0.9%（w/w）混合均勻調(diào)至中性，設(shè)計F1與F2兩個試驗組，每組3個重復(fù)。F1自然放置8 d；F2處理如下：將培養(yǎng)好的解淀粉芽孢桿菌CM3、解淀粉芽孢桿菌Lh-1與微白黃鏈霉菌G-1 3種菌懸液按1∶1∶2的比例混合均勻，然后按3%（V/W）的接種量接種到3個重復(fù)的白酒糟中混勻，在低于45 ℃的條件下發(fā)酵8 d，總菌量＞109cfu/g備用。

1.5 清香型白酒糟生物有機肥指標檢測

1.5.1 清香型白酒糟生物有機肥微生物多樣性檢測

在F1與F2的每個重復(fù)中隨機選擇5個采樣點，每個采樣點取100 g樣品后混勻，共6個樣品，4 ℃保存于自封袋內(nèi)運回。對采回的樣品進行梯度稀釋，并在不同的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，分別統(tǒng)計樣品中的細菌、放線菌與真菌數(shù)量[12]。

1.5.2 清香型白酒糟生物有機肥理化指標檢測

取新鮮樣品，按1∶10（g∶mL）比例用蒸餾水稀釋，水浴振蕩30 min，取上清，測定pH值、電導(dǎo)率、吸光度（665 nm）。種子的發(fā)芽指數(shù)與含水率的相關(guān)檢測方法見參考文獻[15-16]。

1.6 試驗設(shè)計

2020年9月，在晉中市榆次區(qū)東陽試驗基地的日光溫室內(nèi)進行盆栽試驗。在營養(yǎng)缽（裝土300 g）中進行黃瓜育苗，待出苗后將黃瓜苗移栽入盆缽（裝土10 kg）中進行培養(yǎng)。試驗設(shè)計為3個試驗組，每組分為3個試驗小區(qū)，共9個試驗小區(qū)（完全隨機分布），每個試驗小區(qū)內(nèi)放置盆缽30個：（1）對照組（CK），不添加任何肥料；（2）試驗組1（T1）以2%（w/w）的施入量向土壤中添加自然放置的清香型白酒糟并混合均勻；（3）試驗組2（T2）以2%（w/w）的施入量向土壤中添加經(jīng)二次發(fā)酵的清香型白酒糟生物有機肥并混合均勻。篩選均一度好的黃瓜種子，一粒黃瓜種子穴播于不同處理的營養(yǎng)缽中進行育苗，淘汰不出苗的營養(yǎng)缽，瓜苗長出4～5片真葉后移栽至對應(yīng)的盆缽中進行常規(guī)盆栽試驗，定期觀測記錄。

1.7 清香型白酒糟生物有機肥的各項肥效指標檢測

待溫室內(nèi)的黃瓜苗定植40 d后，在每個小區(qū)內(nèi)以“S”形隨機取樣的方式采取黃瓜植株5株，并收集該黃瓜植株的根際土壤樣品100 g，用于后續(xù)各項檢測。

黃瓜植株根際土壤中微生物群落的檢測：將每份根際土壤樣品混合均勻后放入自封袋中，4 ℃條件下運回實驗室，采用梯度稀釋法，分別對樣品中的細菌、放線菌與真菌進行統(tǒng)計計數(shù)[17]。

黃瓜葉片理化指標測定：丙二醛（MDA）含量，過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）與超氧化物歧化酶（SOD）活性，具體方法見文獻[18]。

黃瓜生長指標：黃瓜植株的鮮重、干重、葉面積和株高。植株干重采用烘干法，葉面積采用葉面積儀測定法，株高采用直尺測量法。

2 結(jié)果與分析

2.1 清香型白酒糟生物有機肥微生物多樣性檢測

如表1所示，添加復(fù)合菌劑進行二次發(fā)酵后，清香型白酒糟中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變，細菌數(shù)量與放線菌數(shù)量較F1顯著提高并成為絕對優(yōu)勢群落，達到1.47×109cfu/g和1.84×107cfu/g；由于復(fù)合菌劑中沒有真菌，F(xiàn)2中的真菌數(shù)量顯著降低，F(xiàn)1中的真菌數(shù)量是F2的3倍。

表1 清香型白酒糟生物有機肥微生物多樣性檢測

2.2 清香型白酒糟生物有機肥各項理化指標檢測

如表2所示，清香型白酒糟經(jīng)二次發(fā)酵后相比其理化指標發(fā)生了顯著變化。二次發(fā)酵后F2含水率較F1下降了13.52%。這是因為水分是發(fā)酵過程中微生物群落活躍程度的重要反映指標之一，微生物的擴繁與代謝等活動會持續(xù)消耗水分，從而使水分減少。pH值是影響作物生長的重要指標之一，添加復(fù)合菌劑進行二次發(fā)酵后物料由中性向偏堿性轉(zhuǎn)變，其pH值達到8.15，符合腐熟肥料的酸堿度要求。電導(dǎo)率（EC）是反映肥料浸提液中的有機酸鹽類和無機鹽含量的指標，一般而言肥料電導(dǎo)率＜9.0 mS/cm，不會抑制種子發(fā)芽[19]，F(xiàn)2處理相較于F1而言，電導(dǎo)率顯著下降。吸光度（OD665）的值可以作為肥料腐殖化程度的參考指標，通常腐熟有機肥料的OD665＜0.008[20]。由表2可知，F(xiàn)1的吸光度值未達到腐熟標準，而F2的吸光度值符合腐熟肥料的標準。種子發(fā)芽指數(shù)（GI）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中反映肥料腐熟與否的權(quán)威標準，GI＜50%說明肥料中有毒物質(zhì)的含量超過了植物可以承受的范圍，GI值為50%～85%時說明該肥料還沒有完全腐熟，肥料中仍有部分有害物質(zhì)會對植株的生長造成影響，GI＞85%說明該肥料已經(jīng)達到完全腐熟狀態(tài)，可以進行施用[21]。F1的GI值為68.64%，表示酒糟沒有腐熟，對植株生長有影響；F2的GI值為86.04%，說明二次發(fā)酵后的酒糟有機肥已經(jīng)達到完全腐熟狀態(tài)。

表2 清香型白酒糟生物有機肥理化指標檢測

2.3 施用不同肥料對黃瓜根際土壤微生物群落多樣性的影響

不同肥料處理對黃瓜根際土壤微生物群落的影響如表3所示。從表3可以看出，細菌成為根際土壤微生物的優(yōu)勢類群，其占比為70%～90%，與另外2個處理相比，T2處理顯著提高了微生物群落中的細菌數(shù)量與放線菌數(shù)量（10.55×107cfu/g、9.64×105cfu/g）；一般黃瓜的土傳病害都是由真菌引起的，而T2處理的根際土壤中真菌數(shù)量顯著低于其他兩個處理（1.63×105cfu/g）。與CK相比，T1處理放線菌數(shù)量顯著提高（3.75×105cfu/g），而細菌數(shù)量和真菌數(shù)量則與CK差異不顯著。

表3 黃瓜根際微生物群落多樣性檢測

2.4 黃瓜葉片理化指標的檢測

對于植株而言，抗氧化保護酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT），非常重要。當植株體內(nèi)處于受脅迫的狀態(tài)時會產(chǎn)生氧自由基，抗氧化保護酶可以有效清除這些氧自由基從而提高植株系統(tǒng)抗性；而丙二醛（MDA）含量反映植物細胞膜質(zhì)過氧化程度，含量越高說明膜質(zhì)受害越重[1]。由表4可知，施用清香型白酒糟生物有機肥（T2）后黃瓜葉片中的SOD、POD在3個處理組中活性最高 [8.05 g/（U·min ） 和 9.84 g/（U·min）]，CAT活性與T1處理差異不顯著但二者均高于CK處理組，MDA含量最低（僅為5.17 μmol/g）；T1處理組黃瓜葉片的MDA含量在3個處理組中最高（7.56 μmol/g），POD與CAT活性均顯著高于CK，SOD活性與CK差異不顯著。

表4 黃瓜葉片理化指標的檢測

2.5 黃瓜生長指標的檢測

施用不同肥料后各處理的黃瓜株高、葉面積指數(shù)、植株地上部分鮮重與干重的差異如表5所示。從表5可知，施用清香型白酒糟生物有機肥（T2）后黃瓜植株長勢較其他處理優(yōu)勢顯著，4項指標均為最優(yōu)；T1處理組的株高與CK沒有顯著差異，其他3項指標均優(yōu)于CK處理；CK處理各項指標均為最低。結(jié)果說明，施用清香型白酒糟生物有機肥可以顯著促進黃瓜植株的生長。

表5 黃瓜生長指標的檢測

3 結(jié)論

清香型白酒糟因只進行2輪發(fā)酵取酒，酒糟中的各種營養(yǎng)物質(zhì)較其他白酒糟豐富許多，因此是制作生物有機肥的理想原材料[22]。但經(jīng)試驗證明其理化指標與腐熟肥料相比還存在一定差距,無法直接應(yīng)用。本試驗以微生物復(fù)合菌劑為發(fā)酵劑對清香型白酒糟進行二次發(fā)酵，發(fā)酵后含菌量符合生物有機肥標準，制成的清香型白酒糟生物有機肥與自然放置的酒糟相比理化性質(zhì)發(fā)生了顯著改變，其pH值為8.15、電導(dǎo)率為5.02 mS/cm、OD665為0.005 5、種子發(fā)芽指數(shù)達到86.04%，達到了腐熟肥料的技術(shù)標準。

施用清香型白酒糟生物有機肥后黃瓜植株根際微生物群落結(jié)構(gòu)與其他2組處理相比發(fā)生了定向改變。一般黃瓜的土傳病害都是由真菌引起的，施肥后群落中的細菌數(shù)量和放線菌數(shù)量顯著提高，真菌數(shù)量顯著下降，這說明施入清香型白酒糟生物有機肥后黃瓜植株根際土壤的微環(huán)境得到了有效改善。黃瓜葉片中抗氧化保護酶與丙二醛的含量也證實了這一點，施用清香型白酒糟生物有機肥后3種抗氧化保護酶的含量顯著提高而丙二醛含量顯著下降。施用自然放置的白酒糟后葉片中的丙二醛含量最高，說明未完全腐熟的物料對黃瓜植株有一定的毒害作用。F2處理中黃瓜的株高、葉面積指數(shù)、鮮重和干重與其他2個處理組相比均為最高，再一次說明施用清香型白酒糟生物有機肥可顯著促進黃瓜植株的生長。

綜上所述，利用復(fù)合菌劑對清香型白酒糟進行二次發(fā)酵可使酒糟完全腐熟，制成的生物有機肥對黃瓜生長具有顯著的促進作用，應(yīng)用前景良好。