錦燈籠醇提取物通過lncRNA AK093987基因的表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制研究

黃余峰 于立江 崔麗華 陳靜 孫長春 侯娟 吳志偉 王釗 楊曦

結(jié)腸癌是最致命的癌癥之一，也是最常見的飲食相關(guān)癌癥[1,2]。目前，結(jié)腸癌可通過結(jié)腸切除、化學(xué)療法、靶向療法、激素療法和免疫療法治療[3]。但這些策略仍無法滿足臨床需求，包括延長患者生存期，預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移和降低復(fù)發(fā)率[4]。為提高結(jié)腸癌患者存活率和改善治療效果，需要開發(fā)和評估具有抗癌特性的新藥物。錦燈籠(calyx seu fructus physalis)是茄科植物酸漿的干燥宿萼或帶果實的宿萼，迄今為止，錦燈籠提取物被證明通過增殖抑制和凋亡促進(jìn)來發(fā)揮對肝癌[5]、肺癌[6]的抗癌活性。然而錦燈籠對結(jié)腸癌是否存在抗腫瘤作用，目前仍不清楚。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，包括結(jié)腸癌[7]。既往資料表明，lncRNA AK093987在結(jié)腸癌中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)不利于結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的增殖[8]。但lncRNA AK093987在錦燈籠調(diào)節(jié)結(jié)腸癌進(jìn)展中的作用仍然未知。因此，本研究探討錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并通過其對結(jié)腸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AK093987的調(diào)控作用，旨在闡明錦燈籠醇提取物的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29獲自武漢Procell公司，將其置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并于37℃、5% CO2、飽和濕潤的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 試劑 細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)、Annexin V-FITC試劑盒、RIPA裂解物(美國Sigma-Aldrich)，TRIzol試劑(美國Thermo Fisher)，PrimeScript RT試劑盒、SYBER Green master mix試劑盒、si-lncRNA AK093987、si-NC、pcDNA-lncRNA AK093987、pcDNA-NC(大連TaKaRa)。錦燈籠藥材(干燥宿萼)粉碎過40目篩后，以1∶20的料液比加入80%乙醇，浸泡12 h后進(jìn)行回流提取，時間2 h，重復(fù)2次。將2次回流提取的濾液合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏，干燥后即得錦燈籠醇提取物[9]，得率約為29.52%。實驗時，將錦燈籠醇提取物用培養(yǎng)基稀釋為2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的濃度備用。

1.3 實驗分組與處理 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29分為NC組：正常培養(yǎng)，對照；低劑量組：2.5 μg/ml錦燈籠醇提取物作用48 h；中劑量組：5 μg/ml錦燈籠醇提取物作用48 h；高劑量組：10 μg/ml錦燈籠醇提取物作用48 h；si-NC組：轉(zhuǎn)染si-NC 48 h；si-lncRNA AK093987組：轉(zhuǎn)染si-lncRNA AK093987 48 h；高劑量+pcDNA-NC組：10 μg/ml錦燈籠醇提取物+轉(zhuǎn)染pcDNA-NC；高劑量+pcDNA-lncRNA AK093987組：10 μg/ml錦燈籠醇提取物+轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA AK093987。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，遵循Lipofectamine 2000試劑的說明步驟，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-lncRNA AK093987、pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA AK093987。其中，pcDNA-NC和pcDNA-lncRNA AK093987轉(zhuǎn)染6 h后，用含10 μg/ml錦燈籠醇提取物的培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)9孔。

1.4 Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase-3)表達(dá) 結(jié)腸癌細(xì)胞HT29用RIPA裂解物提取總蛋白。接下來，將蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上于100 V分離1.8 h。將蛋白進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脫脂牛奶封閉1 h。將CyclinD1抗體(1∶1 000)、Cleaved-caspase-3抗體(1∶1 000)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體(1∶1 000；對照)在4℃下與膜孵育過夜。此外，用0.1% Tween-PBS清洗膜后，用二抗(1∶10 000)探測蛋白，并用ECL顯影。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞處理48 h后，按照CCK-8試劑說明書的指示，對96孔板中2×104個結(jié)腸癌細(xì)胞HT29進(jìn)行CCK-8反應(yīng)。反應(yīng)1 h后，在Multiskan酶標(biāo)儀上讀取各組450 nm的吸光度A值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集結(jié)腸癌細(xì)胞HT29，以1 000 r/min的速度在4℃下離心4 min，并調(diào)整為1×106個細(xì)胞/ml。然后將HT29細(xì)胞在1 ml冷PBS中洗滌2次，加入200 μl結(jié)合緩沖液。用10 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)在室溫下處理細(xì)胞15 min，然后加入300 μl結(jié)合緩沖液，立即通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測lncRNA AK093987表達(dá) 使用TRIzol提取結(jié)腸癌細(xì)胞HT29總RNA，通過NanoDrop 2000c分光光度計檢查總RNA的質(zhì)量和數(shù)量。cDNA的合成通過PrimeScript RT試劑盒進(jìn)行，將正向引物、反向引物、cDNA模板、雙蒸水與SYBER Green master mix等混合在一起進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。lncRNA AK093987的表達(dá)水平被標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，并使用2-ΔΔCt法計算。lncRNA AK093987與GAPDH引物由上海生工公司合成，參照Tang等[7]的報道。每個獨立實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的影響 與NC組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組錦燈籠醇提取物減少結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，降低細(xì)胞增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表1。

表1 不同濃度錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖的影響

圖1 Western blot檢測CyclinD1蛋白的表達(dá)

2.2 錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響 與NC組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組錦燈籠醇提取物增加結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的凋亡率，提高Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響;A Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá);B 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

表2 錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響

2.3 錦燈籠醇提取物對lncRNA AK093987表達(dá)的影響 低劑量組、中劑量組和高劑量組錦燈籠醇提取物作用后，結(jié)腸癌細(xì)胞HT29內(nèi)lncRNA AK093987的表達(dá)水平均低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 錦燈籠醇提取物對lncRNA AK093987表達(dá)的影響

2.4 si-lncRNA AK093987對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡的影響 si-lncRNA AK093987組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中l(wèi)ncRNA AK093987、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平和增殖能力低于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平和凋亡率高于si-NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 si-lncRNA AK093987對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡的影響

圖3 Western blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.5 lncRNA AK093987可以逆轉(zhuǎn)錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡的影響 高劑量+pcDNA-lncRNA AK093987組結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中l(wèi)ncRNA AK093987、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平和增殖能力高于高劑量+pcDNA-NC組，Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平和凋亡率低于高劑量+pcDNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表5 lncRNA AK093987可以逆轉(zhuǎn)錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和凋亡的影響

3 討論

近年來，越來越多的中藥被臨床用于癌癥的輔助治療。錦燈籠作為一種藥用價值廣泛的中藥，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化[10,11]、抗微生物和利尿[12]等活性。關(guān)于錦燈籠抗腫瘤機(jī)制的研究大多數(shù)集中在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖方面，例如錦燈籠醇提取物以時間和劑量依賴方式減弱肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖[5]，錦燈籠水提物以濃度依賴方式降低肺癌SPC-A-1細(xì)胞的增殖能力，并以濃度依賴方式加速其凋亡[6]。這充分揭示了錦燈籠在細(xì)胞生長過程中的潛在作用和抗腫瘤活性。

致癌作用與細(xì)胞觸發(fā)凋亡能力的逐步降低有關(guān)，凋亡是重要的腫瘤抑制機(jī)制，也是癌癥發(fā)展的重要障礙[13,14]。因此本研究探討錦燈籠醇提取物在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，結(jié)果表明，錦燈籠醇提取物在2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的濃度下，均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖能力，并且誘導(dǎo)凋亡，這與前述報道相近。另外，CyclinD1是公認(rèn)的腫瘤啟動子[15]，caspase-3的活化對刺激細(xì)胞凋亡至關(guān)重要[16]。本研究中，2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中CyclinD1的下調(diào)和對Cleaved-caspase-3的上調(diào)也證明了其抗增殖和促凋亡的能力。這些結(jié)果提供了新的證據(jù)，提示錦燈籠醇提取物具有一定的抗結(jié)腸癌潛力。

lncRNA在癌癥進(jìn)展中的作用早已得到研究[17]。lncRNA AK093987被認(rèn)為是腫瘤診斷和治療的候選生物標(biāo)志之一。此前，Tang等[7]揭示了lncRNA AK093987在結(jié)腸癌中高表達(dá)，下調(diào)lncRNA AK093987使結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖受到抑制。此外，lncRNA AK093987在胃癌[18]與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[19]中同樣高表達(dá)，能夠加速腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，是結(jié)腸癌、胃癌和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤重要的預(yù)后因素。但除了這幾項報告，目前筆者發(fā)現(xiàn)仍然缺乏關(guān)于lncRNA AK093987的其他資料。

本研究觀察到，結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中l(wèi)ncRNA AK093987被錦燈籠醇提取物顯著下調(diào)。轉(zhuǎn)染si-lncRNA AK093987后，結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖和CyclinD1表達(dá)顯著減弱，Cleaved-caspase-3表達(dá)和凋亡率顯著增強(qiáng)，與前人研究[7,18,19]吻合，提示lncRNA AK093987是結(jié)腸癌的致癌因子。根據(jù)報道，lncRNA與一些藥物的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)，例如lincRNA-p21通過穩(wěn)定結(jié)腸癌中的鈣黏附蛋白來介導(dǎo)銀杏葉提取物EGb 761的抗癌作用[20]。為進(jìn)一步考察lncRNA AK093987是否涉及錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA AK093987以過表達(dá)lncRNA AK093987，發(fā)現(xiàn)錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖、凋亡、CyclinD1和Cleaved-caspase-3表達(dá)的影響被過表達(dá)lncRNA AK093987所逆轉(zhuǎn)。綜合這些結(jié)果，錦燈籠醇提取物發(fā)揮抗結(jié)腸癌的作用可能是通過下調(diào)lncRNA AK093987表達(dá)來實現(xiàn)的。

綜上所述，錦燈籠醇提取物對結(jié)腸癌顯示出抗腫瘤活性，可能通過下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA AK093987的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。這些結(jié)果可能為錦燈籠在結(jié)腸癌治療中的潛在用途提供新的線索。