恩諾沙星和環(huán)丙沙星在肉雞體內(nèi)殘留與代謝研究進(jìn)展

陳蘇蒙，薛 毅，趙程祥，賈 曼，張宏達(dá)，陳 剛*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081；2.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；3.天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，天津 300384)

喹諾酮類藥物是動物使用最廣泛的抗生素之一，它們在動物中的主要用途是治療細(xì)菌感染、預(yù)防感染和作為食用動物的生長促進(jìn)劑[1-2]。我國大部分肉雞養(yǎng)殖環(huán)境較差，不法商販為降低肉雞的病死率，存在使用禁用獸藥與抗生素等行為，同時(shí)由于政府監(jiān)管不到位，導(dǎo)致我國肉雞養(yǎng)殖尚存在較大的食品安全隱患[3]。在動物養(yǎng)殖中濫用抗生素，以及在動物接受抗生素治療后，或者在藥物代謝排泄之前屠宰藥物動物，可能導(dǎo)致這些抗生素及其代謝物殘留在供人類食用的食品中。攝入這種食物可能會導(dǎo)致健康風(fēng)險(xiǎn)，如過敏問題、毒性問題，以及抗生素殘余物通過食物鏈傳遞給人類時(shí)，導(dǎo)致耐藥菌株的數(shù)量增加而產(chǎn)生的耐藥問題[4]。為了規(guī)范這些藥物的使用，制定了動物食品中的這些抗生素最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)的一系列政策和措施，包括根據(jù)每個(gè)物種和組織中的MRL，以此來避免對消費(fèi)者健康造成風(fēng)險(xiǎn)。然而目前制定的MRL只限制于活性化合物(抗生素)或主要的已知代謝物，而其他未知代謝物和轉(zhuǎn)化物可能通過與生物物質(zhì)相互作用或自身代謝形成，不包括在食品中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星最大殘留限量(GB31650-2019)法規(guī)中。因此，有必要對這些未知代謝物和轉(zhuǎn)化物進(jìn)行研究，以了解可能對人類健康產(chǎn)生的相關(guān)毒性或有害影響，并避免產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果[5-6]。本文綜述恩諾沙星與環(huán)丙沙星兩種常用的喹諾酮類藥物在肉雞體內(nèi)殘留與代謝物檢測方面(研究方法主要包括：高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競爭抑制方法)的研究進(jìn)展，并探究恩諾沙星、環(huán)丙沙星在不同品類雞中代謝分布與殘留消除規(guī)律的異同，為進(jìn)一步研究喹諾酮類藥物在不同品種肉雞中的殘留與代謝物檢測提供參考。

1 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在肉雞方面的殘留檢測研究

1.1 高效液相色譜(HPLC)法 高效液相色譜具有溶質(zhì)擴(kuò)散速度快、在較短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)數(shù)據(jù)的優(yōu)點(diǎn)。高雪梅等[7]選取40日齡，體重為1.5±0.2 kg的黃羽肉雞進(jìn)行100 mg/L恩諾沙星飲水給藥，混飲7 d后，取肌肉、全肝、全腎，經(jīng)處理檢測后，結(jié)果表明：在肌肉及肝臟停藥后7 d、腎臟停藥后3 d的組織中，恩諾沙星殘留量均低于規(guī)定MRL。并且表明在零休藥期時(shí)，肝臟中的殘留量大于肌肉大于腎臟，藥物在肝臟中消除最為緩慢。Garcia-Ovando H等[8]開發(fā)了一種提取和液相色譜測定雞肌肉中恩諾沙星殘留的技術(shù)。肌肉樣品用二氯甲烷和離心三步提取以從肌肉中分離恩諾沙星，檢測限(LOD)為0.00048 μg/mL，定量限(LOQ)為0.0039 μg/mL，回收率平均為86.67%。鄭育基[9]建立的HPLC可同時(shí)檢測雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量，此方法的LOD與LOQ分別為0.01 μg/mL與0.05 μg/mL，回收率在87.26%～106.36%。

Aslam B 等[10]采用HPLC檢測肉(n=75)和肝臟(n=75)樣品中恩諾沙星殘留，肉類和肝臟樣品中恩諾沙星的總體平均殘留濃度分別為208±55 μg/kg和527±84 μg/kg。該研究表明，52%的肉類和78.7%的肝臟樣本對恩諾沙星呈陽性，58.3%肉和71.2%肝臟樣品殘留濃度高于MRL，使用這種受污染的肉類可能會引起消費(fèi)者的抵抗，并且對公共健康構(gòu)成威脅。Verma M K等[11]收集了來自家禽養(yǎng)殖場和零售市場的雞肉樣品(包括肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)。分析結(jié)果顯示，43.58%的肉類樣本對恩諾沙星呈陽性，38.71%肉類樣本對環(huán)丙沙星呈陽性。其中，45.17%的樣品濃度高于恩諾沙星的MRL，50.28%的樣品濃度高于環(huán)丙沙星MRL。因此,可以得出結(jié)論，在雞肉中使用這些抗菌劑對肉類可能會造成污染，導(dǎo)致消費(fèi)者產(chǎn)生耐藥性，對公共健康構(gòu)成威脅[12]。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法 為了獲得更加精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，研究者們將液相色譜與質(zhì)譜法串聯(lián)共同檢測物質(zhì)的含量[13]。Arslan-Acaroz D等[14]通過LC-MS/MS方法研究雞肝臟樣品，方法檢測限為1.17 mg/kg(恩諾沙星)和1.24 mg/kg(環(huán)丙沙星)。分別在39%和31%的樣品中檢測到恩諾沙星和環(huán)丙沙星，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有雞肉中兩種抗生素殘留水平的總和遠(yuǎn)低于規(guī)定的最大殘留水平。Zamoum R等[15]采用LC-MS/MS法檢測和鑒定雞肉中磺胺類和喹諾酮類的殘留，151只雞樣品來自阿爾及利亞中部地區(qū)17個(gè)城市的30個(gè)屠宰場。結(jié)果表明，至少43%的樣品中存在抗生素，喹諾酮類藥物的篩查顯示樣品的污染百分比為26.5%，其中恩諾沙星占19.86%。

潘麗花[16]建立的HPLC-MS/MS方法則可在雞可食性組織中同時(shí)測定27種喹諾酮類藥物(含恩諾沙星與環(huán)丙沙星)的含量。Martin B S等[17]選取白來航白羽肉仔雞，進(jìn)行了10 mg/kg的恩諾沙星肌肉注射，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測，藥物殘留量均低于歐盟和日本MRL。孫紅洋等[18]建立的HPLC-MS/MS方法可檢測恩諾沙星與環(huán)丙沙星在雞蛋及雞可食性組織中的殘留量。此方法的LOD與LOQ分別為1 μg/kg與5 μg/kg，兩種藥物的平均回收率范圍在75.5%～106%之間。

1.3 膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競爭抑制法 膠體金技術(shù)具有特異敏感性，且其穩(wěn)定性強(qiáng)，競爭性抑制可阻礙底物與酶的結(jié)合，從而判斷出酶的活性部位等。孫曉崢[19]等采用了膠體金標(biāo)記單克隆抗體及競爭抑制法檢測肉雞中喹諾酮類藥物，并組裝了檢測氟喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星等10種)抗生素殘留的膠體金免疫層析試紙條，以供目標(biāo)藥物的快速檢測。王宵雪等[20]建立了膠體金免疫層析分析方法，15種喹諾酮類藥物及8種常用獸藥對恩諾沙星免疫膠體金快速檢測均無明顯干擾，表明膠體金檢測氟喹諾酮類抗生素殘留具有良好的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性，且操作簡單、檢測快速，適合現(xiàn)場檢測。Ha M S等[21]通過熒光染料標(biāo)記的微粒與恩諾沙星分子共價(jià)結(jié)合，溶液中的恩諾沙星與微粒固定的恩諾沙星(enroMPs)競爭結(jié)合芯片上的抗體，結(jié)合恩諾沙星的微粒會出現(xiàn)熒光來檢測恩諾沙星。在最佳條件下，恩諾沙星實(shí)現(xiàn)了高動態(tài)范圍濃度范圍為1～1000 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測限和定量限分別為5 μg/kg和20 μg/kg，明顯低于最大殘留限量。使用簡單的提取方法，強(qiáng)化牛肉、豬肉和雞肉樣品的回收率為43.4%～62.3%。由于其靈敏度、特異性、簡單性和快速性，將有助于以高通量方式檢測和近似定量食品中的恩諾沙星殘留。

1.4 其他檢測方法 Panzenhagen P H N等[22]研究調(diào)查了恩諾沙星ELISA 檢測試劑盒與 LC-MS/MS 相比檢測肉雞組織中恩諾沙星殘留的效率。從6個(gè)不同的屠宰場獲得 72 個(gè)樣品的肉雞組織。ELISA和HPLC被用來鑒定和量化樣品對恩諾沙星的污染。總共72%的分析樣品含有恩諾沙星ELISA檢測到的殘留物和22.2%的殘留物被LC-MS/MS檢測到。所有通過LC-MS/MS檢測到的恩諾沙星殘留陽性樣品通過ELISA也呈陽性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了ELISA測試的效率，并建議將其用作家禽組織中恩諾沙星殘留的篩選方法，因?yàn)樗Y(jié)果快、價(jià)格低且適用性強(qiáng)。

Barrón D等[23]提出了一種以馬波沙星為內(nèi)標(biāo)分析雞肌肉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的方法。樣品的凈化和預(yù)濃縮通過固相萃取進(jìn)行，并使用光電二極管陣列檢測器通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行測定，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的校準(zhǔn)曲線在10～300 μg/kg范圍內(nèi)呈線性，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的方法回收率分別為74%和54%，這兩種化合物的檢測限低于25 μg/kg，這允許在所需的最大殘留限下檢測陽性肌肉樣品。Rasheed C M等[24]開發(fā)了一種新穎、簡單、快速、應(yīng)用廣泛且可靠的衍生分光光度法，用于測定恩諾沙星。一階導(dǎo)數(shù)分光光度法測定恩諾沙星的濃度范圍為0.3～31.0 μg/kg，回收率在93.01%～103.67%的范圍內(nèi)，該方法用于測定不同雞肌肉、肝臟和腎臟樣品中的這些抗生素。

2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星在代謝轉(zhuǎn)化方面的研究

陳杖榴等[25]發(fā)現(xiàn)在家禽使用恩諾沙星后，藥物在體內(nèi)廣泛分布，主要通過腎臟可排泄15%～50%的原形藥物；肝臟為次要代謝消除的途徑，主要代謝物為環(huán)丙沙星，次要代謝產(chǎn)物為恩諾沙星氧化物與葡萄糖醛酸結(jié)合物；環(huán)丙沙星在1.8～2.0 kg肉雞體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為去乙烯環(huán)丙沙星與氧基環(huán)丙沙星。Slana M等[26]利用HPLC法研究了肉雞連續(xù)5 d口服恩諾沙星對其代謝和排泄的影響，并證實(shí)了恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星、去乙烯恩諾沙星(DES-EF)和去乙烯環(huán)丙沙星(DES-CF)的存在。恩諾沙星飲水給藥后1～13 d，恩諾沙星在第1天至第13天期間主要以母體化合物的形式排出。在第1天至第6天的排泄物中檢測到環(huán)丙沙星，而少量的去DES-EF與去DES-CF僅分別在第1天至第7天和第1天至第6天排泄。Morales-Gutierrez F J等[27]使用LC-MS技術(shù)鑒定了雞肌肉中恩諾沙星與環(huán)丙沙星的新代謝物與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(TPs)。結(jié)果檢測出了21種恩諾沙星TPs，6種環(huán)丙沙星TPs，以及14種代謝產(chǎn)物。并表明去乙烯-喹諾酮是最顯著的TPs，以及含量較低的其他代謝產(chǎn)物，如哌嗪環(huán)裂解、芳香環(huán)去氟以及芳香環(huán)去氟雙羥基化后的產(chǎn)物。

圖1 恩諾沙星主要代謝產(chǎn)物

圖2 環(huán)丙沙星主要代謝產(chǎn)物

柳愛春等[28]的研究發(fā)現(xiàn)恩諾沙星在麻雞黃羽肉雞體內(nèi)轉(zhuǎn)化率高，代謝慢，環(huán)丙沙星在麻雞黃羽肉雞體內(nèi)轉(zhuǎn)化率較低，其中肝臟中主要TPs與恩諾沙星的代謝產(chǎn)物相似，為培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星及氧氟沙星。而應(yīng)翔宇等[29]在白羽艾維茵肉雞體內(nèi)注射恩諾沙星后的代謝產(chǎn)物中未檢測出環(huán)丙沙星。對于恩諾沙星在雞中的主要代謝產(chǎn)物研究結(jié)果不同，推測可能是由于實(shí)驗(yàn)雞的不同品種或品類導(dǎo)致藥物在雞體內(nèi)的代謝消除速率不同，從而在不同檢測時(shí)間點(diǎn)檢測出的代謝物含量有較大差異，致使出現(xiàn)在檢測時(shí)無目標(biāo)代謝物的現(xiàn)象。

Turnipseed S B等[30]建立了四極飛行時(shí)間(Q-TOF)液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析獸藥殘留轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星的主要?dú)埩羰黔h(huán)丙沙星，另一種與恩諾沙星不同的氟喹諾酮類藥物，通過在線數(shù)據(jù)庫搜索具有相同分子量的氟喹諾酮化合物，最終證明為培氟沙星損失-CO2和-C4H7NO2的相對應(yīng)的低質(zhì)量產(chǎn)物離子。ANADO'N A等[31]給健康雞單次靜脈注射和口服環(huán)丙沙星(8 mg/kg)，測定環(huán)丙沙星及其代謝物的藥代動力學(xué)特性。靜脈注射和口服給藥后，血漿濃度-時(shí)間曲線具有二室開放模型的特征。環(huán)丙沙星主要轉(zhuǎn)化為氧環(huán)丙沙星和去乙烯環(huán)丙沙星。當(dāng)口服環(huán)丙沙星(連續(xù)3 d 8 mg/kg)時(shí)，發(fā)現(xiàn)相當(dāng)多的腎臟、肝臟、肌肉和皮膚脂肪組織中含有環(huán)丙沙星及其代謝物惡環(huán)丙沙星和去亞乙基環(huán)丙沙星。Haag G等[32]為了研究肉雞羽毛中恩諾沙星/環(huán)丙沙星殘留的藥代動力學(xué)，建立高效液相色譜-熒光法定量測定肉雞羽毛中殘留的恩諾沙星和環(huán)丙沙星，計(jì)算這些藥物在人類食用前的等待時(shí)間，研究結(jié)果表明在9 d內(nèi)在羽毛中檢測到這兩種化合物。這種分析方法表現(xiàn)出良好的線性，選擇性，準(zhǔn)確度和精密度，該研究在研究羽毛中恩諾沙星/環(huán)丙沙星殘留方面具有重要應(yīng)用。

3 展 望

經(jīng)上述研究總結(jié)目前制定的恩諾沙星和環(huán)丙沙星的MRL只限制于原藥形式或主要的已知代謝物的檢測，恩諾沙星主要代謝物為環(huán)丙沙星、去乙烯環(huán)丙沙星、培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星及氧氟沙星；環(huán)丙沙星主要代謝物為培氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星和去乙烯環(huán)丙沙星，而其他未知代謝物和轉(zhuǎn)化物研究較少，因此，有必要對這些未知代謝物和轉(zhuǎn)化物建立相關(guān)的研究方法，以完善其相對應(yīng)的法律法規(guī)。其次發(fā)現(xiàn)在2020版《中國獸藥典》與GB31650-2019中都未提及環(huán)丙沙星的用法用量，建議進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究并完善相應(yīng)的資料內(nèi)容。最后，發(fā)現(xiàn)抗菌藥物在烏骨雞體內(nèi)的殘留消除時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品類雞，推測主要原因是由于氟喹諾酮類藥物通過堿性氮原子與烏骨雞體內(nèi)的黑色素結(jié)合，導(dǎo)致氟喹諾酮類藥物在烏雞皮脂及肌肉內(nèi)殘留濃度較高，對于此現(xiàn)象，將來可進(jìn)行烏骨雞黑色素基因方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步分析其代謝消除較慢的具體原因。