小鵝瘟病毒熒光RPA恒溫快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

高 遠(yuǎn)，徐龍濤，馮宗玲，曲光剛，李本科

(1．榮成市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東榮成 264399；2．齊魯動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南 250100；3．濱州市科技創(chuàng)新發(fā)展研究院，山東濱州 256600；4．山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；5．濱州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東濱州 256600)

小鵝瘟是一種常見的水禽急性或亞急性敗血性傳染病，臨床特征主要表現(xiàn)為厭食、渴欲增強(qiáng)、無(wú)力、不愿活動(dòng)，常表現(xiàn)出搖頭癥狀[1]。該病的發(fā)病病程短，傳染性強(qiáng)，死亡率高，可高達(dá)90%～100%，但發(fā)病率和致死率隨著雛鵝的日益長(zhǎng)大而下降[2]。該病由小鵝瘟病毒(Goose parvovirus，GPV)引起。1956年我國(guó)學(xué)者方定一在揚(yáng)州首次發(fā)現(xiàn)并分離到第一株小鵝瘟病毒，1961年他又用鵝胚分離到一株與雞新城疫及鴨肝炎病毒無(wú)關(guān)的新病毒，并將該病命名為小鵝瘟，病原體稱為小鵝瘟病毒[3]。此后許多國(guó)家都報(bào)道過該疾病，包括英國(guó)和瑞典等，對(duì)全球的養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。GPV主要感染雛鵝和番鴨，其它家禽能夠天然抵抗該病毒的感染[4]。GPV屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬，是一種無(wú)包膜的單鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為5100 bp，包含兩個(gè)開放閱讀框(ORF)：位于5’端的ORF1編碼參與病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)控蛋白，位于3’端的ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3。表面結(jié)構(gòu)蛋白表現(xiàn)出病毒的遺傳變異，編碼這些結(jié)構(gòu)蛋白的基因突變改變了病毒的免疫特性。由于VP2和VP3基因區(qū)域同時(shí)包含保守區(qū)和可變區(qū)而被專門用于檢測(cè)病毒進(jìn)化和遺傳變異。

目前，GPV的檢測(cè)方法多種多樣，主要包括病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)方法主要是病毒的分離鑒定[5]，是檢測(cè)小鵝瘟最經(jīng)典和最準(zhǔn)確的方法之一，但是該方法檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，不滿足小鵝瘟臨床快速檢測(cè)的需求。血清學(xué)檢測(cè)主要包括瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)[6]、病毒中和試驗(yàn)[7]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[8]、反向間接血凝試驗(yàn)[9]、免疫熒光抗體法[10]、免疫過氧化物酶染技術(shù)[11]、對(duì)流免疫電泳法[12]和精子凝集抑制試驗(yàn)[13]等，但是上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，或檢測(cè)靈敏度低，或檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，或操作復(fù)雜等。分子生物學(xué)檢測(cè)主要有PCR檢測(cè)、核酸探針技術(shù)、熒光定量PCR檢測(cè)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等。2006年，李福偉等[14]建立了檢測(cè)GPV的PCR檢測(cè)方法，并針對(duì)保守序列VP3設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，成功擴(kuò)增出GPV VP3基因的目的片段，敏感性可達(dá)到8 pg。2005年，布日額等[15]建立了另一種核酸探針方法，以SCPD為底物的化學(xué)發(fā)光的地高辛標(biāo)記核酸探針檢測(cè)GPV，該方法特異性、敏感性和適用性都很強(qiáng)，但其技術(shù)性要求較強(qiáng)，操作繁瑣，且檢測(cè)成本較高，不適宜臨床上的推廣與應(yīng)用。2010年，龍朕等[16]根據(jù)GPV的保守序列NS基因建立了熒光PCR檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性和特異性，但是該方法需要熒光定量PCR儀，不方便攜帶，不滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。2012年，金文杰等[17]建立了LAMP技術(shù)應(yīng)用于GPV的快速診斷，縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是該方法不僅需要設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，而且極易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification, RPA)是2006年由英國(guó)科學(xué)家研發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。它是利用多種酶參與，如重組酶、單鏈結(jié)合蛋白、外鏈核酸酶III和鏈置換DNA聚合酶，在體外模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因大量擴(kuò)增。重組酶與引物結(jié)合形成復(fù)合物，在雙鏈DNA中尋找同源序列，一旦定位到同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)，形成并啟動(dòng)DNA合成，模板上的靶區(qū)進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，被取代的DNA鏈與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，防止進(jìn)一步的替代。RPA技術(shù)自2006年首次引入我國(guó)便受到了廣泛關(guān)注，隨后出現(xiàn)了大量關(guān)于該技術(shù)的研究，近年來(lái)取得顯著進(jìn)展[18-19]。RPA技術(shù)可在37～42 ℃恒溫條件下快速擴(kuò)增，DNA擴(kuò)增到可檢測(cè)水平所需的時(shí)間取決于樣品的DNA拷貝數(shù)，結(jié)果一般可以在20 min內(nèi)觀察到。RPA檢測(cè)對(duì)樣品制備要求低，具有恒溫、快速、便攜、靈敏度高、特異性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[20]，是目前有望替代PCR技術(shù)的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以VP3基因?yàn)槟康幕蚪⒘藱z測(cè)GPV的RPA恒溫快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸及臨床樣本 鵝副黏病毒、鵝源鴨瘟病毒、小鵝流行性感冒病毒、鵝副傷寒病毒、大腸桿菌、曲霉菌和GPV均保存于齊魯動(dòng)保實(shí)驗(yàn)室；小鵝瘟臨床病料由山東養(yǎng)鵝廠提供。

1.2 GPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank公布的GPV的全基因組序列，利用分子生物學(xué)軟件primer premier 5.0，針對(duì)VP3保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(表1)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 GPV擴(kuò)增引物

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出1605 bp的VP3片段，并構(gòu)建重組質(zhì)粒GPV-VP3-18T，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌株，使用質(zhì)粒提取Mini試劑盒Ⅰ(OMEGA，USA)提取質(zhì)粒DNA。用NanoDrop-2000分光光度計(jì)(NanoDrop, Wilmington, USA)定量質(zhì)粒DNA的濃度，將重組質(zhì)粒送上海生工測(cè)序鑒定。

1.3 熒光RPA恒溫快速檢測(cè)方法引物與探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank收錄的GPV的VP3序列，利用primer premier 5.0軟件，根據(jù)RPA引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)GPV VP3基因特異性的引物和探針(表2)，并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表2 GPV的RPA引物和探針

1.4 核酸的提取及反轉(zhuǎn)錄 使用AXYGEN試劑盒(AXYGEN，美國(guó))提取GPV、鵝副黏病毒、鵝源鴨瘟病毒、小鵝流行性感冒病毒、鵝副傷寒病毒的核酸，用20 μL無(wú)核酸酶水洗脫病毒中的核酸，使用NanoDrop-2000分光光度計(jì)測(cè)定病毒核酸的濃度。使用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒(康為世紀(jì)，中國(guó))提取大腸桿菌和曲霉菌的基因組DNA。所有核酸樣品提取完成后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript?Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix去除基因組DNA并合成鵝副黏病毒與小鵝流行性感冒病毒cDNA。在Rase Free Microtube管中加入7.0 μL模板RNA、1.0 μL下游引物、1.0 μL TransScript?Ⅱ RT/RI Enzyme Mix、1.0 μL gDNA Remover、10.0 μL 2×TS Ⅱ Reaction Mix配制溶液。混合液在50 ℃孵育30 min后，85 ℃加熱5 s。得到的cDNA溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光RPA恒溫?cái)U(kuò)增方法的建立 熒光RPA恒溫?cái)U(kuò)增方法反應(yīng)體系為：溶解劑10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，探針0.3 μL，激活劑1 μL，模板1 μL，加入去離子水至25 μL；最佳反應(yīng)條件為：40 ℃條件下反應(yīng)20 min。除激活劑和模板外，其余以混合溶液的形式加入含有凍干粉的0.2 mL EP管中，渦旋混合離心。將核酸加到反應(yīng)管中，將激活劑加到反應(yīng)管蓋上。上下顛倒混合后，瞬時(shí)離心；離心后，熒光值由恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀讀取，每30 s監(jiān)測(cè)一次熒光值。以重組質(zhì)粒GPV-VP3-18T為模板，以RNase游離水為陰性對(duì)照，對(duì)該方法的引物濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，具體操作如下：利用同一探針，上下游引物采用3個(gè)濃度梯度(0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1 μmol/L)，確定最佳引物濃度；利用最佳引物濃度采用3個(gè)反應(yīng)梯度溫度(38 ℃、40 ℃、42 ℃)，確定該方法的最佳反應(yīng)溫度。熒光值由恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀讀取，每30 s監(jiān)測(cè)一次熒光值。恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)S型曲線判為檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。

1.6 RPA的敏感性和特異性測(cè)定 為測(cè)定建立的熒光RPA檢測(cè)方法的敏感性，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行連續(xù)的10倍稀釋，作為熒光RPA檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入1 μL作為反應(yīng)模板進(jìn)行RPA反應(yīng)擴(kuò)增以確定該方法的最低檢測(cè)拷貝數(shù)。同時(shí)，以鵝常見疾病不同病原體基因組DNA或RNA作為模板分析該熒光RPA檢測(cè)方法的特異性。采用優(yōu)化后的方法分別對(duì)鵝副黏病毒cDNA、鵝源鴨瘟病毒DNA、小鵝流行性感冒病毒cDNA、鵝副傷寒病毒DNA、大腸桿菌DNA和曲霉菌DNA進(jìn)行檢測(cè)，以GPV的陽(yáng)性樣品為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定該方法的特異性。

1.7 RPA的重復(fù)性測(cè)定 分別以濃度為1×103、1×102、1×101copies/μL的GPV-VP3-18T標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度重復(fù)三次，根據(jù)其Ct值計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.8 RPA、PCR和Real-time PCR的敏感性比較 對(duì)已建立的GPV PCR[21]和GPV Real-time PCR[22]檢測(cè)方法與本研究建立的GPV RPA檢測(cè)方法進(jìn)行敏感性比較。使用AXYGEN試劑盒提取GPV的基因組DNA并將提取的核酸進(jìn)行10倍倍比稀釋作為模板，同時(shí)用PCR、Real-time PCR和RPA三種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，比較三種方法的檢測(cè)敏感度。

1.9 臨床病料的檢測(cè) 從山東省不同的養(yǎng)殖場(chǎng)或農(nóng)戶采集了100份疑似組織、血液和體液樣本，使用AXYGEN試劑盒提取核酸，采用本研究建立的RPA方法和Real-time PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，分析兩種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPV VP3基因PCR擴(kuò)增 通過PCR方法擴(kuò)增靶標(biāo)基因VP3，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳成像(圖1)，結(jié)果表明本研究成功擴(kuò)增出GPV VP3目的條帶，目的片段大小約為1605 bp，與預(yù)期大小一致。

M：DL-2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：陰性對(duì)照；2：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 菌液PCR鑒定結(jié)果 挑取單菌落過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，泳道6的陰性結(jié)果成立，泳道1-5的結(jié)果為GPV陽(yáng)性(圖2)，根據(jù)結(jié)果將檢測(cè)為陽(yáng)性菌液的樣本進(jìn)行質(zhì)粒提取并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示5個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒插入片段均為目的基因，表明VP3基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DL-2000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-5：菌液樣品；6：陰性對(duì)照

2.3 引物的篩選 所有設(shè)計(jì)的GPV引物組合均有S型的擴(kuò)增曲線，其中GPV-F1和GPV-R1組合所得的熒光值為4000，Ct值為7.0(圖3)，均為最佳，故確定最佳引物組合為GPV-F1和GPV-R1。

1-6：引物GPV-F1-R1、GPV-F3-R1、GPV-F2-R1、GPV-F1-R2、GPV-F2-R2、GPV-F3-R2；7-12：引物陰性對(duì)照GPV-F1-R1、GPV-F1-R2、GPV-F2-R1、GPV-F2-R2、GPV-F3-R1、GPV-F3-R2 1-6：Primers GPV-F1-R1、GPV-F3-R1、GPV-F2-R1、GPV-F1-R2、GPV-F2-R2、GPV-F3-R2；7-12：Negative control of primers GPV-F1-R1、GPV-F1-R2、GPV-F2-R1、GPV-F2-R2、GPV-F3-R1、GPV-F3-R2

2.4 引物濃度優(yōu)化 測(cè)試引物濃度分別為0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1 μmol/L，其中引物濃度為1 μmol/L時(shí)出峰時(shí)間最早，且其熒光值最高(圖4)，故最佳引物濃度選擇1 μmol/L。

1: 1 μmol/L primers; 2: 0.8 μmol/L primers; 3: 0.6 μmol/L primers; 4: Negative control

2.5 反應(yīng)溫度優(yōu)化 GPV RPA方法采用的反應(yīng)溫度分別為38 ℃、40 ℃、42 ℃，其中40 ℃出峰時(shí)間最早，Ct值為6.0，其熒光值最高，為4500(圖5)，故最佳反應(yīng)溫度確定為40 ℃。

A: 38 ℃; B: 40 ℃; C: 42 ℃

2.6 敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果 GPV RPA檢測(cè)方法只擴(kuò)增出GPV核酸，其他病毒或細(xì)菌的核酸均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)，說明該方法具有很好的特異性(圖6)。GPV熒光RPA檢測(cè)方法最低能夠檢測(cè)到10 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(圖7)。

1：GPV病毒；2：陰性對(duì)照3：鵝副黏病毒；4：鵝源鴨瘟病毒；5：小鵝流行性感冒病毒；6：鵝副傷寒病毒；7：大腸桿菌；8：曲霉菌

1: 105copies/μL; 2: 104copies/μL; 3: 103copies/μL; 4: 102copies/μL; 5: 101copies/μL; 6: 100copies/μL; 7: Negative control

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以三種不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該方法的重復(fù)性，拷貝數(shù)為1000 copies/μL時(shí)，Ct值為7.3、7.3、8.0，變異系數(shù)為5.36%，熒光值為4600、4500、4500，重復(fù)性良好(圖8A)；拷貝數(shù)為100 copies/μL時(shí)，Ct值為9.3、9.3、9.0，變異系數(shù)為1.88%，熒光值為4000、3900、3850，重復(fù)性良好(圖8B)；拷貝數(shù)為10 copies/μL時(shí)Ct值為10.0、10.0、10.3，變異系數(shù)為1.71%，熒光值為2600、2700、2500，重復(fù)性良好(圖8C)。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

A:模板拷貝數(shù)為1000 copies/μL；B:模板拷貝數(shù)為100 copies/μL；C:模板拷貝數(shù)為10 copies/μL

2.8 RPA、PCR和Real-time PCR的敏感性比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照已建立的檢測(cè)條件，用相同稀釋倍數(shù)的核酸作為模板同時(shí)利用PCR、Real-time PCR和RPA三種方法進(jìn)行檢測(cè)。其中，PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到的核酸稀釋倍數(shù)為103(圖9)， Real-time PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到的核酸稀釋倍數(shù)為105(圖10)，而RPA檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到的核酸稀釋倍數(shù)為104(圖11)。

1：100稀釋；2：101稀釋；3：102稀釋；4：103稀釋；5：104稀釋；6：105稀釋；M：DL-2000 DNA Marker

1：100稀釋；2：101稀釋；3：102稀釋；4：103稀釋；5：104稀釋；6：105稀釋；7：陰性對(duì)照

1：100稀釋；2：101稀釋；3：102稀釋；4：103稀釋；5：104稀釋；6：105稀釋；7：陰性對(duì)照

2.9 臨床病料的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)收集到的100個(gè)臨床疑似樣本同時(shí)采用已建立的RPA方法和Real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3，兩種方法的符合率為99%。

表3 GPV RPA與Real-time PCR方法臨床樣本檢測(cè)符合性試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

GPV主要感染各種鵝、番鴨和莫斯科鴨，該病毒對(duì)幼鵝致死率可達(dá)100%，對(duì)大日齡鵝呈亞臨床感染從而傳染給幼鵝，給養(yǎng)鵝行業(yè)造成巨大損失。因此，GPV的快速診斷是預(yù)防和控制該病的重要前提。本研究采用了一種基于EXO探針的RPA檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)GPV，可以在40 ℃恒溫條件下20 min內(nèi)完成檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)10 copies/μL，僅可檢測(cè)GPV，變異系數(shù)低于6%，具有良好的特異性和重復(fù)性；與Real-time PCR方法的符合率達(dá)到99%。

根據(jù)已報(bào)道的GPV PCR[21]和Real-time PCR[22]檢測(cè)方法，比較了RPA與該兩種方法的敏感性。結(jié)果表明，RPA的敏感性比PCR高10倍，但比Real-time PCR低10倍(圖9-圖11)。與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)[17]檢測(cè)方法檢測(cè)GPV相比，LAMP檢測(cè)需要3對(duì)引物、更高的溫度(62 ℃)和更長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間，而RPA檢測(cè)方法僅需要一對(duì)引物和一個(gè)探針，因此，該方法更簡(jiǎn)單，所需時(shí)間更短。

本研究建立的GPV RPA方法有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，RPA試劑以凍干粉的形式制備，室溫下可保存12周而不失去活性，與其他試劑相比，RPA試劑穩(wěn)定。其次，RPA快速檢測(cè)方法在恒溫條件下進(jìn)行，不需要昂貴的熱循環(huán)器，成本更低。第三，合成的RPA引物和探針可容許有5～9個(gè)錯(cuò)配，對(duì)實(shí)驗(yàn)性能沒有影響，而Real-time PCR錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致探針失效或失去靈敏度。第四，PRA反應(yīng)對(duì)常見的PCR抑制劑有一定的耐受性，從而保證了反應(yīng)的穩(wěn)定性。

本研究成功建立了一種GPV的RPA恒溫檢測(cè)方法，對(duì)GPV現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)試劑盒的開發(fā)具有重要意義。