催產(chǎn)素在絨山羊人工輸精中的應用研究

趙 霞,愛倫高娃,馬躍軍, 樊 東,烏仁圖亞,蘇雅拉圖，烏尼爾夫

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031； 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院；3.赤峰市巴林左旗畜牧工作站；4.赤峰市巴林左旗烏蘭達壩蘇木動物防疫站5.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院)

絨山羊是內(nèi)蒙古自治區(qū)具有自主供種能力的特色草食家畜品種，內(nèi)蒙古自治區(qū)是我國絨山羊數(shù)量和產(chǎn)絨量第一的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)。為保護優(yōu)質(zhì)絨山羊品種，提升絨山羊產(chǎn)業(yè)的核心競爭力，實現(xiàn)絨山羊產(chǎn)業(yè)的轉型升級，開展高繁高產(chǎn)型絨山羊的選育以及高端絨肉產(chǎn)品的開發(fā)、研發(fā)高效的絨山羊人工輸精技術并應用于生產(chǎn)實踐，實現(xiàn)絨山羊凍精供種，對于降低養(yǎng)殖成本和建立良種繁育體系具有重要意義。

在絨山羊生產(chǎn)中，人工授精是最著名和最常用的繁殖技術，人工輸精技術對快速推廣良種，擴大種公羊的利用率，減少疾病傳播，減少母羊空懷起到積極作用的同時為良種的推廣利用提供可靠的系譜檔案并節(jié)約飼草料以及減少經(jīng)濟支出。隨著精液保存技術和同期發(fā)情技術的成熟我們可以用保存的精液，通過運輸可使母畜配種不受地區(qū)和時間的限制，有效地解決供種不足的問題。當前我國農(nóng)村牧區(qū)養(yǎng)羊業(yè)分散，優(yōu)秀種公羊數(shù)量少、質(zhì)量差、常年混群飼養(yǎng)管理、亂交亂配等問題嚴重。人工輸精可以集中供精、集中配種，可充分發(fā)揮優(yōu)秀公羊的作用，成為加快羊群改良步伐的最有效的途徑，具有重要現(xiàn)實意義。

同期發(fā)情技術更是便于組織配種，可使絨山羊大批量生產(chǎn)，有利于羊群抓膘，節(jié)約勞動力，更利于發(fā)揮人工輸精的優(yōu)點，擴大利用優(yōu)秀種公羊，使羔羊年齡整齊，便于管理，做到一年生產(chǎn)2胎或兩年3胎，做到均衡上市，全年供應。當前國內(nèi)絨山羊精液冷凍技術水平與國外同類研究較于過時，且絨山羊冷凍精液解凍后的成活率不穩(wěn)定，研究報道的受胎率結果差異較大。本研究針對同期發(fā)情人工授精情期受胎率低的主要問題，為提高自然發(fā)情和同步發(fā)情絨山羊在繁殖季節(jié)人工授精后的受孕率，我們采用不同的發(fā)情處理方法、不同的輸精方法進行試驗，為提高絨山羊人工輸精受胎率的提高提供科學參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗藥品

產(chǎn)輕松(寧波)10 IU/支、PMSG(1 000IU/支)、孕酮海綿栓(42 mg/支)均由寧波第二激素制品有限公司生產(chǎn)，胚胎保存液(新西蘭進口)，青霉素，生理鹽水，碘酊，酒精，新潔爾滅等相關耗材。

1.2 母羊

赤峰市巴林右旗養(yǎng)殖戶選擇繁殖機能正常、體質(zhì)健壯、營養(yǎng)狀況良好，膘情中等以上的適齡母羊，并在預試期內(nèi)完成驅蟲和常規(guī)防疫注射。

1.3 種公羊

選擇35歲精力旺盛，生殖系統(tǒng)發(fā)育正常，兩側睪丸勻稱，無疾病和缺陷，性欲旺盛，中等以上膘情、精液品質(zhì)好的優(yōu)秀公羊。

2 方法

2.1 母羊的飼養(yǎng)管理

參加輸精的母羊均來自同一飼養(yǎng)管理條件的養(yǎng)殖場。配種季節(jié)來臨之前，及時做好羔羊斷奶、整群、預防接種、驅蟲、藥浴等工作，使參與配種的母羊有充裕的時間來充分抓膘，根據(jù)配種計劃把母羊組群。在配種時母羊膘情要中上等以上，初次參加配種的母羊體重要求達成年母羊的70%以上。

2.2 母羊的處理

針對XOZ平面和YOZ平面，設計2套相互獨立的糾偏控制器。對每套控制器而言，不僅需要考慮位移的偏移，也需要考慮偏斜的角度，輸入量分別為偏移ε和角度偏差θ，以及其相應的改變量Δε、Δθ，輸出量為支撐油缸的液壓缸壓力差ΔP。在2套互相獨立的糾偏控制器共同作用下，可實現(xiàn)豎井掘進機的糾偏控制。

張小波的同學和出租車司機提供的“中年男子”身高、臉形，特別是頭發(fā)有點彎的特征，都與李桂明大體相同，然而，在調(diào)查李桂明時，卻發(fā)現(xiàn)他不具備作案時間。

第二組：根據(jù)配種計劃任選一天在母羊陰道內(nèi)放置孕酮海綿栓。海綿栓放置后的第10～14 d任意一天撤栓，同時肌內(nèi)注射PMSG200IU，撤栓后的24 h開始用試情公羊進行試情，早晚各一次，并做好觀察記錄。并分兩組進行輸精，輸精時一組注射催產(chǎn)素2～4 mL，一組不注射。

2.3 種公羊的飼養(yǎng)管理

借助假陰道，誘導公羊射精。成年公羊每日采精2～3次，連續(xù)采精時讓公羊休息5～10 min即可采集。

式中：P、Q為線路負載有功功率和無功功率；U為線路首端線電壓?？梢钥闯觯诰€路負載一定的條件下，線路末端電壓主要由線路電阻R和電抗X確定，且線路電抗X往往大于電阻R，因此，降低電抗X能有效降解決低電壓問題。

2.4 公羊的采精

種公羊要常年注意飼養(yǎng)管理，維持中等以上的膘情。配種以前的一個半月開始加強飼養(yǎng)管理，按配種期日糧標準飼喂，保證飼料中的蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)的供給。在配種前45 d開始采精排出附睪積存的大量衰老、死亡的精子并做好精液品質(zhì)鑒定。

2.5 輸精

通過試情挑選出穩(wěn)定接受公羊爬跨的受體母羊進行輸精。上午發(fā)情的羊下午輸精一次，下午發(fā)情的羊隔日上午輸精一次。第二次輸精時嚴格檢查母羊陰道黏液的變化，當黏液稠而略帶黃色、不結塊時進行輸精；使用開膣器擴張陰道，借助一定的光源找到宮頸外口，然后用輸精器把精液輸?shù)奖M可能送到的深度。本次試驗輸精時間為母羊發(fā)情后的約12～14 h和發(fā)情后的22～24 h進行兩次輸精。催產(chǎn)素組羊輸精前20～30 min均注射產(chǎn)輕松(催產(chǎn)素)2～4 mL。

2.6 輸精后母羊的管理

輸精后的母羊每天補飼優(yōu)質(zhì)干草、青干草、青貯飼料，妊娠后期適量補充精料、微量元素等。輸精35～40 d后B超儀檢測妊娠情況，統(tǒng)計受胎率。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析(ANOVA)后，采用Etukey-Kramer檢驗評估統(tǒng)計學差異，P<0.05被認為是差異顯著。

在自然情況下，交配發(fā)生在發(fā)情初期或前期，而排卵則發(fā)生在發(fā)情期結束前后，卵子保持受精能力的時間大致為5～6 h，而精子在母羊生殖道內(nèi)維持受精能力的時間較長，一般為1～2 d。當精子進入生殖道，精子快速運行至受精部位，時間要先于卵子許多時間，在此時間精子得以獲能。所以輸精應在排卵前充分的時間內(nèi)進行，以便排卵時在受精部位(輸卵管壺腹部)沉積大量精子。因此，總的原則是輸精應在卵子排出以前或正在排卵過程中進行，排卵后輸精，受精的可能性逐漸降低，甚至不能受精；但也不能過早，否則精子衰老，活力降低，也很難達到受精的目的。在常規(guī)輸精情況下，每天進行兩次人工輸精可以得到滿意的妊娠率。

3 結果與討論

3.1 催產(chǎn)素在人工輸精中的應用研究

此次試驗在9月中旬在同一地點、同一飼養(yǎng)管理條件下，將養(yǎng)殖場羊隨機分組實施。輸精前20～30 min，我們根據(jù)發(fā)情羊胎次、年齡、個體大小注射不同劑量的催產(chǎn)素；在進行經(jīng)宮頸輸精時使用帶有刻度的自制輸精針測量輸精針進入宮頸管深度。

結果如表1所示，無催產(chǎn)素處理羊宮頸通透性和催產(chǎn)素處理羊宮頸通透性有顯著差異(P<0.05)。無催產(chǎn)素處理羊發(fā)情后輸精器進入宮頸管深度約0.5～1.0 cm，占發(fā)情羊23.21%；注射催產(chǎn)素后發(fā)情羊輸精器進入宮頸管深度約1～2 cm，占發(fā)情羊73.21%。

第一組：在沒有同期發(fā)情處理的大群羊中用試情公羊進行試情，早晚各一次，試出穩(wěn)定接受爬跨的發(fā)情母羊，并做好觀察記錄。并分兩組進行輸精，輸精時一組注射催產(chǎn)素2～4 mL、一組不注射。

表1 催產(chǎn)素處理后羊宮頸通透性情況

3.2 不同發(fā)情處理方法及輸精次數(shù)對妊娠率的影

我們對用不同方法處理的發(fā)情母羊進行單次和兩次輸精，輸精后的第35～40 d，B超進行妊娠鑒定，輸精后妊娠率如表2所示。自然發(fā)情組妊娠率和同期發(fā)情組妊娠率有顯著差異(P<0.05)；在自然發(fā)情組催產(chǎn)素處理羊妊娠率顯著高于無催產(chǎn)素羊妊娠率；單次輸精和兩次輸精妊娠率無顯著差異(P>0.05)。同期發(fā)情組催產(chǎn)素處理羊妊娠率顯著高于無催產(chǎn)素組妊娠率(P<0.05)；單次輸精和兩次輸精妊娠率無顯著差異(P>0.05)。

為了改善羊子宮頸的通透性，盡可能地把精液輸入子宮內(nèi)較深的部位，本研究提供了自然發(fā)情、同期發(fā)情山羊使用催產(chǎn)素進行處理，采用新鮮精液進行人工授精后的絨山羊妊娠率數(shù)據(jù)。與其他研究一致，我們的研究也表明人工授精后的妊娠率是受多因素影響的，未進行催產(chǎn)素處理的自然發(fā)情、單次輸精山羊最低妊娠率(48%)這個值不能令人滿意的一個原因可能是輸精時間和排卵時間之間的差異。山羊的發(fā)情持續(xù)時間在24～48 h之間變化較大，排卵往往發(fā)生在發(fā)情期結束前后，在發(fā)情行為開始后的9～37 h都有可能排卵，所以輸精應在排卵前充分的時間內(nèi)進行，以便在排卵時在受精部位壺腹部形成大量精子。故此，在穩(wěn)定接受試情公羊爬跨發(fā)情開始時進行人工授精會導致妊娠率下降，這可以解釋上述結果。

表2 不同發(fā)情處理、不同輸精方法、輸精次數(shù)對妊娠率的影

3.3 討論

母羊子宮頸結構特殊，是一括約肌樣的結構，向后突入于陰道內(nèi)。它的特征具有很厚的壁和一條狹窄的管腔。在反芻動物中，這些凸起形成橫的或螺旋形的互相契合的嵴，形成輪狀環(huán)，通常有四個環(huán)，它們在牛羊上特別顯著，互相契合而將子宮頸嚴密地封鎖。這些輪狀環(huán)結構和加上缺乏有效的人工授精方法是造成妊娠率低的主要原因之一。試驗發(fā)現(xiàn)宮頸內(nèi)授精越深，精子到達受精點越多，受精率隨之提高，從而致使母羊妊娠率增加。在宮頸部分穿通時，部分或全部精液會回流到陰道內(nèi)，而陰道內(nèi)的酸堿度對精子不利；在子宮頸中段穿刺術中，大量精子幾乎在子宮頸環(huán)內(nèi)進入死胡同，無法進入子宮內(nèi)。所以常規(guī)輸精和過宮頸第一皺褶輸精受胎率低是可以理解的。

參加試驗的羊按計劃分兩組進行輸精。第一組羊為大群試情挑選的自然發(fā)情羊，第二組為采用孕酮海綿栓進行處理后發(fā)情的羊。

“昆北”陰平聲字“家”的唱調(diào)（《紫釵記·折柳》【寄生草】“可笑自家”，761），該單字唱調(diào)的過腔是。其中的即第一節(jié)級音性過腔，即第二節(jié)主調(diào)性過腔，由此構成的也是“級音+主調(diào)”兩節(jié)型過腔。

由于羊子宮頸末端有4～5個漏斗狀環(huán)，因此經(jīng)宮頸宮內(nèi)輸精，子宮頸是一個強大的屏障。目前，在山羊的人工輸精，特別是冷凍精液的輸精，只有通過腹腔鏡輔助宮內(nèi)人工授精術才能獲得較為滿意的妊娠率。但其成本、侵入性和對專業(yè)勞動力的需求限制了腹腔鏡輸精的廣泛使用。針對催素對宮頸擴張的有效作用，本研究將催產(chǎn)素用于經(jīng)宮頸人工輸精工作中。經(jīng)宮頸人工輸精技術是具有無創(chuàng)性輸精技術，除品種外，凍精質(zhì)量、精子數(shù)量、母羊情況和輸精時間、輸精次數(shù)的影響外，宮頸的穿透性直接影響精液能否輸送到授精部位。壺腹部是經(jīng)宮頸輸精成功率的重要因素。

經(jīng)宮頸人工授精時輸精針通過時，母羊子宮頸需要擴張。因此，我們在受精前20 min給母羊注射催產(chǎn)素。催產(chǎn)素啟動膠原分解酶過程，導致宮頸擴張，有記錄表明催產(chǎn)素引起母羊宮頸擴張。這種效應是由COX2mRNA的表達和PGE2的產(chǎn)生介導的。PGE2開始重構宮頸細胞外基質(zhì)，導致宮頸擴張。此外，催產(chǎn)素還可提高胚胎移植過程中損傷的胚胎、宮內(nèi)、宮頸的修復功能速度。另外，催產(chǎn)素增加子宮收縮，但對精子轉移到壺腹部沒有任何有害影響。

本試驗發(fā)現(xiàn)自然發(fā)情、同期發(fā)情羊使用催產(chǎn)素處理后宮頸通透性從不使用催產(chǎn)素母羊宮頸通透性大幅度提高；發(fā)情后輸精時輸精器從宮頸管進入的深度約0.2～0.5 cm，占發(fā)情羊的(23.21%)提高到了輸精器進入宮頸管深度(1.5～2.0 cm以上)，占發(fā)情羊的(73.21%)；從表1發(fā)現(xiàn)使用催產(chǎn)素、兩次人工授精母羊的妊娠率都有提高的趨勢。所以不難發(fā)現(xiàn)，人工授精后成功受孕的其他先決條件是，在排卵前立即將足夠的可受精精子存入子宮頸內(nèi)。在本研究中，催產(chǎn)素的使用提高了宮頸松弛度，是輸精器能夠深部輸精，使精子沉積更深，致使受胎率明顯高于自然發(fā)情，無催產(chǎn)素處理母羊人工輸精后的受胎率。

2.1.2 子宮出血常見的4種類型:(1)月經(jīng)過多:周期規(guī)則,但是經(jīng)量過多(>80m1)或者經(jīng)期延長(>7天);(2)月經(jīng)頻發(fā):周期規(guī)則,但是短于21天;(3)子宮不規(guī)則出血:周期不規(guī)則,可在兩次月經(jīng)之間的任何時候發(fā)生出血;(4)月經(jīng)頻多:周期不規(guī)則,經(jīng)量過多。

兩次人工輸精10～12 h的間隔提供了更高的精子細胞，這也可能是更好的懷孕結果的一個原因。兩次輸精的效果取決于排卵有關的第一次授精的時間。因此，在發(fā)情初期進行第一次授精比在發(fā)情中期或發(fā)情末期進行第一次授精的效果更可靠。在發(fā)情后10～12 h和20～22 h進行兩次輸精的效果有可能是由于輸精是人工的，所以有充足的精子減少了受精前卵子的等待時間；此外，兩次輸精可能會阻止與排卵有關的輸精過早進行的可能性。兩次輸精的效果取決于第一次輸精與排卵的關系。在本研究中，兩次輸精妊娠率均有提高的趨勢，但無顯著差異 。

本方法建立了一種適用于中國西北降水量少的地區(qū)降塵總量采集與測試方法，克服了液體樣品少的問題，把液體樣品和固體樣品集中處理成固體樣品一次性測試，減少了測試的成本與誤差。方法對采樣的具體要求進行了討論，對方法的準確度、精密度、加標情況進行了驗證，得到了滿意的結果。

與此形成鮮明對照的是中共的宣傳。中共提出的“打倒軍閥”“打倒帝國主義”“打土豪分田地”等口號深入人心，在大革命時期幾乎主導了國民黨的意識形態(tài)宣傳。胡漢民在“四一二”清黨后，對中共口號的威力仍心有余悸，認為口號是中共的一大利器，“即社會上耳熟口順恬不為怪者——多半為共產(chǎn)黨所制造”?。中共意識形態(tài)宣傳的巨大影響力主要得益于中共抓住了時代精神，體現(xiàn)了當時一般民眾的現(xiàn)實需求。

同步發(fā)情山羊的妊娠率達到了令人滿意的水平，同期發(fā)情羊妊娠率均高于自然發(fā)情羊妊娠率。在同步山羊中，孕激素的初步分布通過負反饋調(diào)節(jié)垂體LH的分泌，改變下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH的分泌。它導致海綿停藥后黃體生成素同步釋放，并與注射的PMSG使大量卵泡發(fā)育，進而同步排卵。本研究中單次人工輸精和兩次人工輸精妊娠率差異不顯著，說明次數(shù)對懷孕率影響不大。同步發(fā)情對人工輸精成功的積極影響還表現(xiàn)在，同步發(fā)情山羊的總妊娠率(76.15%)顯著高于自然發(fā)情羊總妊娠率59.17% (P<0.05)。發(fā)情同步導致大量母羊同時發(fā)情和集中排卵，在被受精成功的最佳時間排出成熟卵子并能受精產(chǎn)羔。

在實際的生產(chǎn)中，我們使用孕酮海綿栓對母羊進行同期發(fā)情處理，所以生殖系統(tǒng)會發(fā)生不同程度的炎癥，導致常規(guī)輸精方法輸精妊娠率較低，本研究使用催產(chǎn)素改善宮頸管的通透性，通過經(jīng)宮頸輸精方法，使用特制的輸精針盡可能避開生殖道內(nèi)的炎癥部位和宮頸皺褶這一屏障，把精液盡可能地注入母羊宮頸深部，是一種“無創(chuàng)傷性深部輸精技術”。當精液注入子宮深部時，精液沉積在受精地點較近的地方，特別有利于精子和卵子的結合，與常規(guī)人工輸精方法相比較具有明顯的優(yōu)勢。所以使用催產(chǎn)素經(jīng)宮頸輸精技術的應用研究使輸精后的妊娠率得到了很大幅度的提升，使當前供種不足的情況下使用新鮮精液、冷凍精液進行人工輸精提供了有力的技術保障。

過宮頸輸精是將輸精搶頭插入到子宮頸口內(nèi)進行輸精的一種方法。不同動物宮頸管長度、彎曲度和穿透性差異較大，品種、年齡、產(chǎn)羔史等因素影響輸精器的穿透深度。與綿羊相比山羊特定的特征(對疼痛高度敏感，需要鎮(zhèn)靜和局部麻醉)限制腹腔鏡輸精來提高妊娠率。所以在山羊人工輸精、冷凍精液輸精工作中為得到更好的妊娠率必須縮短輸精時間，需要我們科研人員對經(jīng)宮頸輸精技術進一步的探索研究，以廉價、非手術的輸精技術提高絨山羊人工輸精妊娠率，減少創(chuàng)傷、節(jié)約成本，爭取取得腹腔鏡輸精同樣的高受胎率。

本研究證明在生產(chǎn)中進行人工輸精時我們可以配合催產(chǎn)素進行經(jīng)宮頸人工輸精提高妊娠率是一種高效、廉價、實用的比陰道輸精技術更為有效的輸精技術。利用經(jīng)宮頸輸精技術進行新鮮精液、冷凍精液是一項很有前途的技術，有望成為絨山羊、綿羊品種遺傳改良的重要手段。當前世界各地都在進行研究，以克服人工輸精妊娠率低的問題，特別是羊冷凍精液妊娠率低的技術難關。本研究中我們對精液輸精器的改進和外源性宮頸擴張藥物的使用進行了應用研究，但還需要更深入了解山羊、綿羊的宮頸生理結構和發(fā)情時宮頸自然擴張的機制，以便對羊進行人工輸精，特別是冷凍精液進行經(jīng)宮頸輸精以獲得滿意的妊娠率。

原輔料采購入庫起始于采購中心的采購訂單，倉儲依據(jù)采購訂單核對入庫物料的品種、規(guī)格及數(shù)量進行核對，而質(zhì)檢科及三級站按照質(zhì)量標準對入庫物料進行質(zhì)量抽檢，兩方面檢查通過后即可完成入庫。