中華穿山甲腹瀉治療前后糞便微生物群落組成的差異

頡志剛 毛 韻 謝純剛 許 佳 何海健 蒙海峰 鄭榮泉

(1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江省野生動物生物技術(shù)與保護利用重點實驗室，金華，321004；2.金華市自然資源和規(guī)劃局野保站，金華，321052；3.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，金華，321000；4.金華市陸生野生動物救護中心，金華，321052)

中華穿山甲(Manispentadactyla)隸屬于鱗甲目(Pholidota)，穿山甲科(Manidae)，穿山甲屬。由于人類的過度利用和棲息地被破壞，穿山甲野生種群資源已極度衰退。目前，世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)在其瀕危物種紅色名錄上，將中華穿山甲定為極危(CR)物種，所有種類的穿山甲均被列入華盛頓公約(CITES)附錄Ⅰ中。國家林業(yè)和草原局于2020年6月3日將中華穿山甲升級為國家一級重點保護野生動物。盡管國內(nèi)外相關(guān)機構(gòu)和部分動物園在多年前就已經(jīng)開展了穿山甲的救護和人工飼養(yǎng)工作[1-5]，但救護成功率和飼養(yǎng)成活情況并不理想，目前穿山甲的人工養(yǎng)殖仍是世界難題。

野生穿山甲進入人工圈養(yǎng)環(huán)境后可能受到多種脅迫因素的影響，容易出現(xiàn)免疫或代謝相關(guān)的多種疾病。根據(jù)文獻報道，腸胃炎、肺炎、皮膚病和寄生蟲病是導(dǎo)致圈養(yǎng)穿山甲死亡最常見的疾病[6-8]，超過50%的圈養(yǎng)穿山甲死于出血性胃潰瘍和肺炎[9]，腹瀉是圈養(yǎng)穿山甲最常見的情況之一，也是導(dǎo)致死亡的主要病因之一。野生穿山甲以白蟻等昆蟲為主要食物[10]，在人工圈養(yǎng)條件下難以滿足其對天然餌料的需求，通常需要人工飼料喂養(yǎng)，而不合理的人工飼料以及環(huán)境應(yīng)激可能是導(dǎo)致穿山甲腹瀉發(fā)生的直接原因[9，11]。因為食物組成和生存環(huán)境的改變均可直接或間接干擾動物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)[12-13]，使得條件致病菌成為優(yōu)勢菌群，從而出現(xiàn)腹瀉癥狀和電解質(zhì)紊亂，最終引起動物的死亡。

以浙江省金華市陸生野生動物救護中心救護的2只雌性中華穿山甲為研究對象，利用高通量測序技術(shù)分析和比較2只穿山甲在圈養(yǎng)初期發(fā)生腹瀉和治療恢復(fù)后糞便細(xì)菌和真菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)的變化，旨在為預(yù)防和治療腹瀉提供參考依據(jù)，從而提高圈養(yǎng)中華穿山甲群體的健康水平。

1 基本情況

1.1 動物與飼養(yǎng)條件

研究對象為浙江省金華市陸生野生動物救護中心(位于浙江省穿山甲保護繁育基地內(nèi))救護的2只雌性中華穿山甲(編號為Mp10和Mp13)，救護時間分別為2020年7月13日和7月23日，救護時體重分別為2.13、2.37 kg。單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)(120 cm×80 cm×100 cm)，籠下帶有接糞盤可收集糞便，籠內(nèi)提供木質(zhì)巢箱(50 cm×40 cm×40 cm)，環(huán)境溫度(27±1)℃，濕度(55±5)%。人工飼料以黑螞蟻干、黃粉蟲干、貓糧和葡萄糖為主要原料，按照一定比例配制，加入等體積飲用水后用勻漿機充分粉碎、混合制成糊狀飼料(粗脂肪5.8%、粗蛋白12.6%、粗纖維0.3%，每百克總能量529.0 kJ)，每日現(xiàn)用現(xiàn)配，每天16：30投喂，投喂量按體重計，約為50 g/kg。飼養(yǎng)期間通過人工誘導(dǎo)使穿山甲逐步適應(yīng)人工飼料。

1.2 腹瀉情況與治療方案

2只穿山甲攝食人工飼料一段時間后出現(xiàn)腹瀉癥狀，糞便呈黃色糊狀(圖1A)，但無膿液或水樣，也未出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡和體溫異常等癥狀。初步推測可能是食物改變引起腸道的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致消化不良性腹瀉。針對穿山甲消化不良性腹瀉的治療方案為：每日通過拌料口服蒙脫石散3 g/只(浙江海力生制藥有限公司，有效成分為蒙脫石，輔料為葡萄糖、香蘭素和糖精鈉)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)二聯(lián)活菌顆粒1 g/只(北京韓美藥品有限公司，含益生菌屎腸球菌R-026、枯草桿菌R-179，以及VC、VB1、VB2、VB6、VB12、煙酰胺、乳酸鈣和氧化鋅)。用藥后第6周開始好轉(zhuǎn)，第12周糞便呈黑色條狀(圖1B)。

圖1 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便的形態(tài)Fig.1 The fecal form of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment using probiotics

2 研究方法

2.1 糞便樣品采集

中華穿山甲為夜行性動物，一般在夜間排便。根據(jù)監(jiān)控記錄，2只穿山甲活動時間主要集中在20：00—03：00，排便時間集中在21：00左右或01：00左右，收集糞便的時間選擇在20：00—07：00。

收集時，首先在接糞盤上鋪1層保鮮膜以防止糞便樣品的污染，每隔0.5 h觀察1次排便情況，如有排便立刻收集。為防止外部雜菌污染，用消毒后的鑷子撥開糞便表層，取內(nèi)部適量樣品置于液氮中冷凍，-80 ℃保存。每只穿山甲在治療前后各采集5個糞便樣品，共20個樣品。

2.2 高通量測序

委托北京百邁客生物科技有限公司進行糞便樣品細(xì)菌和真菌的高通量測序。糞便基因組DNA提取采用MN NucleoSpin 96 Soil (Germany)，具體步驟詳見試劑盒說明書。擴增細(xì)菌16S rRNA基因V3—V4區(qū)，引物對為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)；擴增真菌ITS rRNA基因的S1區(qū)域，引物對為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

PCR反應(yīng)體系10.0 μL，其中基因組DNA模板50 ng，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5.0 μL，dNTP(2 mmol/L)2.0 μL，KOD FX Neo 0.2 μL，剩余體積用ddH2O補充。

反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳評估，使用DNA凝膠提取試劑盒純化，最終產(chǎn)物通過文庫制備，庫檢后Illumina HiSeq 2500上機測序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

原始序列組裝用Trimmomatic v0.33質(zhì)控[14]，F(xiàn)LASH v1.2.7拼接[15]，并用UCHIME v8.1去除嵌合體[16]，得到高質(zhì)量的Tags序列。OTU聚類和物種注釋分別使用USEARCH v10.0[17]和RDP分類器v2.2[18]，細(xì)菌16S的參考數(shù)據(jù)庫為Silva數(shù)據(jù)庫[19]，真菌ITS的參考數(shù)據(jù)庫選擇Unite數(shù)據(jù)庫[20]。OTU數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后進行分析和可視化展示，內(nèi)容包括原始數(shù)據(jù)優(yōu)化及有效優(yōu)質(zhì)序列統(tǒng)計。用Mothur v1.30.2計算Alpha多樣性指數(shù)，包括Simpson、Shannon、ACE和Chao1等?；赽inary jaccard算法計算Beta多樣性距離矩陣，使用R軟件進行非度量多維尺度分析(NMDS)。LEfSe分析默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4。

3 結(jié)果與分析

3.1 糞便樣本微生物序列及多樣性

從20個糞便樣品中獲得細(xì)菌原始16S rRNA基因V3—V4區(qū)域序列1 509 222條，質(zhì)控后獲得高質(zhì)量序列1 310 509條，平均每個樣品具有序列41 787條。根據(jù)97%的序列相似性鑒定出356個核心OTU，治療前平均每個樣品含295個OTU，治療后平均每個樣品含204個OTU。真菌原始ITS rRNA基因S1區(qū)域獲得序列1 530 406條，共獲得高質(zhì)量序列1 435 188條，平均每個樣品具有序列71 759條。根據(jù)97%的序列相似性鑒定出1 572個核心OTU，治療前平均每個樣品含301個OTU，治療后平均每個樣品含429個OTU。得到的OTU在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫比對注釋，細(xì)菌共有14個門、24個綱、49個目、77個科和162個屬；真菌共有10個門、33個綱、83個目、184個科、371個屬和484個種。

3.2 微生物群落多樣性

通過比較腹瀉治療前后糞便菌群Alpha多樣性指數(shù)(表1)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落的豐度指數(shù)ACE和Chao 1在治療后均降低，但多樣性指數(shù)Shannon和Simpson前后變化不大；真菌群落ACE在治療后降低，而Chao 1增加，Shannon和Simpson指數(shù)前后無明顯變化。無度量多維標(biāo)定法(NMDS)檢驗結(jié)果顯示，治療前后細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)均發(fā)生了較大程度的變化(圖2)。

表1 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群Alpha多樣性指數(shù)

圖2 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便微生物群落組成非度量多維尺度(NMDS)分析Fig.2 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analysis of fecal microbial community composition of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

3.3 治療前后糞便核心微生物組成及相對豐度

治療前，糞便細(xì)菌群落優(yōu)勢菌門(占比1%以上)依次為厚壁菌門(Firmicutes，65.59%)、變形菌門(Proteobacteria，15.67%)、梭桿菌門(Fusobacteria，8.32%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，6.87%)和酸桿菌門(Acidobacteria，2.16%)；治療后為厚壁菌門(63.58%)、變形菌門(21.73%)、梭桿菌門(10.76%)和擬桿菌門(2.77%)(圖3A)。在屬水平上，治療前的優(yōu)勢菌屬(豐度排序前10)依次為乳桿菌屬(Lactobacillus，24.10%)、狹義梭菌屬1(Clostridiumsensu stricto 1，8.06%)、Cetobacterium(7.21%)、土孢桿菌屬(Terrisporobacter，5.83%)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella，5.67%)、擬桿菌屬(Bacteroides，5.66%)、大腸埃希菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella，5.35%)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia，4.92%)、毛螺旋菌屬(Parasutterella，2.10%)和梭桿菌屬(Fusobacterium，1.08%)；治療后依次為狹義梭菌屬1(23.21%)、羅姆布茨菌屬(12.33%)、愛德華氏菌屬(11.03%)、土孢桿菌屬(6.64%)、梭桿菌屬(6.60%)、毛螺旋菌屬(5.62%)、大腸埃希菌-志賀菌屬(4.02%)、Cetobacterium(3.86%)、擬桿菌屬(2.03%)和乳桿菌屬(0.72%)(圖3B)?？傮w來看，治療前后的優(yōu)勢菌門排序基本一致，但占比發(fā)生了一定變化，擬桿菌門的占比在治療后減少，變形菌門和梭桿菌門增加；屬水平上，優(yōu)勢菌屬在排序和占比上均發(fā)生了較大改變，尤其是乳桿菌屬的占比在治療后明顯減少，而狹義梭菌屬1明顯增加。

圖3 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群組成Fig.3 The composition of fecal microbiota of Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

治療前，糞便真菌群落優(yōu)勢菌門(占比1%以上)依次為子囊菌門(Ascomycota，59.96%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，26.82%)、毛霉菌門(Mucoromycota，1.73%)和被孢霉門(Mortierellomycota，1.11%)；治療后依次為子囊菌門(71.72%)、擔(dān)子菌門(16.57%)、毛霉菌門(1.24%)、被孢霉門(1.15%)和羅茲菌門(Rozellomycota，1.06%)(圖3C)。在屬水平上，治療前，豐度排名前10的優(yōu)勢菌屬依次為絲孢酵母屬(Trichosporon，11.59%)、曲霉屬(Aspergillus，8.09%)、Meyerozyma(5.40%)、青霉屬(Penicillium，4.45%)、紅菇屬(Russula，2.98%)、假絲酵母屬(Candida，2.70%)、鐮刀菌屬(Fusarium，2.12%)、被孢霉屬(Mortierella，1.98%)、Saitozyma(0.54%)和Condenascus(0.32%)；治療后依次為Condenascus(17.49%)、曲霉屬(7.61%)、絲孢酵母屬(4.25%)、假絲酵母屬(4.14%)、Saitozyma(3.34%)，鐮刀菌屬(2.97%)、青霉屬(1.62%)、被孢霉屬(1.42%)、紅菇屬(0.77%)和Meyerozyma(0.08%)(圖3D)。治療前后的優(yōu)勢菌門在排序上基本一致，但占比發(fā)生了一定變化，治療后的子囊菌門占比明顯增加，而擔(dān)子菌門明顯減少；屬水平上，優(yōu)勢菌屬的排序和占比均發(fā)生了較大改變，尤其是Condenascus的占比在治療后明顯增加，而絲孢酵母屬明顯減少；種水平上，豐度排序前10的糞便真菌物種完全一致，但治療后Condenascustortuosus、Candidaafricana和Saitozymapodzolica的相對豐度占比增多，而茶葉籽酵母(Meyerozymacaribbica)、雜色曲霉(Aspergillusversicolor)、青霉菌(Penicilliumhispanicum)和Candidamucifera的相對豐度占比均減少(表2)。

表2 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便真菌在種水平上的相對豐度

3.4 治療前后糞便微生物顯著差異物種

利用LEfSe分析可見，2只腹瀉穿山甲治療前后糞便細(xì)菌屬水平和真菌屬或種水平上的差異。圖4A表明，治療前乳桿菌屬和擬桿菌屬為主要作用物種，而治療后狹義梭菌屬1、羅姆布茨菌屬和狹義梭菌屬13為主要作用物種。圖4B表明，治療前起主要作用的真菌是絲孢酵母屬、Meyerozyma、茶葉籽酵母菌、紅菇屬的Russulapoichilochroa、青霉屬和曲霉屬的雜色曲霉，而治療后起主要作用的真菌是Saitozymapodzolica和Condenascustortuosus。

圖4 中華穿山甲腹瀉治療前后糞便菌群LEfSe分析Fig.4 LEfSe of fecal microbiota of the Chinese pangolins before and after diarrhea treatment

4 討論

本研究對救護過程中出現(xiàn)腹瀉癥狀的2只雌性中華穿山甲進行了成功治療。根據(jù)高通量測序結(jié)果，分析中華穿山甲糞便細(xì)菌和真菌菌群Alpha多樣性，發(fā)現(xiàn)治療使細(xì)菌和真菌(除Chao 1指數(shù)外)的豐富度有所降低，但對細(xì)菌和真菌多樣性的影響不大，經(jīng)Beta多樣性分析，發(fā)現(xiàn)治療前后細(xì)菌和真菌菌群均表現(xiàn)出明顯的分離。然而，對林麝(Moschusberezovskii)的研究表明，腹瀉個體糞便細(xì)菌菌群的Alpha多樣性指數(shù)比健康個體明顯降低，同時兩者糞便菌群呈現(xiàn)出明顯分離，并且研究人員認(rèn)為是有害菌大腸埃希菌-志賀菌屬導(dǎo)致的腹瀉[21]。此外，對馬駒的研究表明，腹瀉個體細(xì)菌OTU總數(shù)和Chao 1指數(shù)顯著低于健康個體，但Alpha多樣性無統(tǒng)計學(xué)差異[22]。對不同物種的研究結(jié)果表明，腹瀉會引起菌群豐度的降低，但不一定會導(dǎo)致Alpha多樣性的降低。在本研究中，引起2只中華穿山甲腹瀉的主要原因可能是食物的改變而非有害菌，腸道菌群調(diào)整需要1個過渡階段，在此階段微生物可能在豐度上發(fā)生了一定變化而在物種多樣性上變化不大，經(jīng)過非抗生素治療后，腸道菌群會調(diào)整為一種新的穩(wěn)態(tài)。

在門水平上，中華穿山甲的細(xì)菌主要優(yōu)勢菌依次為厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門和擬桿菌門，且腹瀉治療前后優(yōu)勢菌門的排序無明顯改變，但占比發(fā)生了一定變化。楊雪婷[23]通過宏基因組測序分析出野外馬來穿山甲(Manisjavanica)腸道細(xì)菌主要為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門；Ma等[24]通過宏基因組學(xué)預(yù)測了2只健康雌性馬來穿山甲與2只不同性別、死于肺部炎癥的穿山甲個體間的糞便細(xì)菌菌群，這4只穿山甲的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門；Yan等[5]比較了在圈養(yǎng)條件下出生與從非法交易中救護后圈養(yǎng)2～3年的馬來穿山甲糞便的微生物組成，這2組穿山甲核心菌門依次為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門。這些研究結(jié)果說明2種穿山甲腸道的優(yōu)勢菌門都包括厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，但同種或異種間在細(xì)菌門類和占比都存在一定差異。此外，對圈養(yǎng)大食蟻獸(Myrmecophagatridactyla)的研究表明，主要菌門為厚壁菌門(41%)、擬桿菌門(42%)和變形菌門(6%)，而小食蟻獸(Tamanduatetradactyla)的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(35%)、厚壁菌門(31%)和變形菌門(3%)[23]，表明食蟻類哺乳動物類群間腸道細(xì)菌群落在門水平上具有一定的相似性。

在屬水平上，中華穿山甲大部分優(yōu)勢菌屬治療前后的豐度發(fā)生了較大變化，尤其是治療后的乳桿菌屬占比明顯減少，而狹義梭菌屬1明顯增加。根據(jù)LEfSe分析，治療前，乳桿菌屬和擬桿菌屬為主要作用物種；治療后，狹義梭菌屬1、羅姆布茨菌屬和狹義梭菌屬13為主要作用物種。擬桿菌屬和乳桿菌屬與纖維素降解和蛋白質(zhì)分解利用有關(guān)[25]，在治療后這2個菌屬占比減少，可能與食物的改變有關(guān)。梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)可以通過丙烯酸途徑發(fā)酵丙氨酸產(chǎn)生丁酸，也可以在蘇氨酸脫氫酶的作用下發(fā)酵蘇氨酸產(chǎn)生丙酸[26]，還具有降解幾丁質(zhì)的能力[27-28]，而羅姆布茨菌屬也與丁酸生成相關(guān)[29]。丙酸和丁酸是動物體內(nèi)葡萄糖、膽固醇和脂質(zhì)代謝的重要代謝底物[30]。日糧中補充丁酸類物質(zhì)能夠改善仔豬腸道發(fā)育，提高機體抗氧化能力和生長性能，并可通過調(diào)節(jié)腸道的通透性降低仔豬腹瀉率[31-32]。因此，治療后腸道內(nèi)狹義梭菌屬和羅姆布茨菌屬豐度的增加對中華穿山甲的能量物質(zhì)代謝和腹瀉癥狀的改善具有積極意義。

有關(guān)穿山甲腸道真菌組成的研究尚未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)，中華穿山甲糞便中的子囊菌門和擔(dān)子菌門為絕對優(yōu)勢菌門，占比1%以上的菌門還包括毛霉菌門和被孢霉門等，治療前后優(yōu)勢菌門的排序變化不大，但占比發(fā)生了一定變化，如治療后子囊菌門占比明顯增加，羅茲菌門占比也有所增加，而擔(dān)子菌門明顯減少。Sokol等[33]發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病患者的擔(dān)子菌門與子囊菌門的比值增加，推測可能與腹瀉有關(guān)。艾生權(quán)等[34]發(fā)現(xiàn)亞成體大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)腸道真菌的優(yōu)勢菌門也主要為子囊菌門和擔(dān)子菌門。穿山甲主要以富含幾丁質(zhì)的蟻類為食，而大熊貓以富含纖維素的竹子為食，這兩類哺乳動物腸道擁有共同的優(yōu)勢真菌菌門，是否與食物特化有關(guān)需要進一步研究。在屬水平上，優(yōu)勢菌屬在治療前后有較大改變。治療后Condenascus占比明顯增加，而絲孢酵母屬明顯減少。在種水平上，雖然排序前10的物種完全一致，但是Condenascustortuosus、Candidaafricana和Saitozymapodzolica的相對豐度在治療后占比增多，而茶葉籽酵母、雜色曲霉、青霉菌和Candidamucifera的相對豐度占比均減少。雖然真菌占腸道微生物的比例較低，但有研究表明真菌與細(xì)菌有密切關(guān)系，存在穩(wěn)定的拮抗或互利共生關(guān)系[35-36]。這些特定真菌的豐度變化具體會對中華穿山甲食物的吸收、利用起到何種作用，以及真菌和細(xì)菌存在何種互作關(guān)系有待深入研究。

綜上所述，野生中華穿山甲在救護飼養(yǎng)過程中可能因食物改變引起消化不良性腹瀉，通過腸道收斂劑類藥物和益生菌調(diào)理可以達到治療目的，這為治療圈養(yǎng)中華穿山甲最為常見的腹瀉疾病提供了初步經(jīng)驗。由于該物種極度瀕危，動物來源非常有限，本研究僅能分析2只腹瀉個體糞便微生物多樣性和組成，雖然生物學(xué)重復(fù)不能完全符合統(tǒng)計學(xué)要求，但本研究結(jié)果仍具有較為重要的參考價值，今后可根據(jù)相關(guān)微生物組成信息有目的地篩選腸道有益菌，以此作為飼料添加劑改善圈養(yǎng)中華穿山甲的健康程度和提高救治成功率等。